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1.
Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白(GFP)标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法:应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度(0.5和1.0mmol·L-1)和不同温度(22℃和37℃)诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。结果:0.5和1.0mmol·L-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温(22℃)诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。结论:低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。  相似文献
2.
目的观察骨髓间充质干细胞(MSC)移植对多器官功能不全综合症(MODS)兔受累器官组织细胞凋亡蛋白酶活化因子-1 mRNA(Apaf-1 mRNA)表达及影响,探讨应用于MODS治疗的可能性和应用前景.方法体外培养、扩增、鉴定兔MSC,慢病毒转基因标记GFP,经股动脉移植,观察MSC移植后,在MODS动物模型宿主内的存活情况.RT-PCR测定MSC移植前后Apaf-1 mRNA在心、脾、肾脏器中的表达变化.结果光镜观察MSC符合MSC细胞形态学的特征;激光共聚焦显微镜观察,移植MSC兔的心、脾、肾脏器组织内有慢病毒转基因标记GFP的MSC存在;流式细胞检测分析MSC不表达血细胞表面标记如CD34、CD45,但表达CD73、CD105;RT-PCR检测结果显示正常心、脾、肾组织中均有Apaf-1 mRNA的表达,模型组心、脾、肾Apaf-1 mRNA的表达较正常组明显增加(P〈0.01),而移植组Apaf-1 mRNA的表达低于模型组(P〈0.01).结论体外培养获得的兔MSC表现MSC形态学特征;移植后的MSC能够定植在MODS兔的受损脏器组织内;MSC能够下调Apaf-1 mRNA在MODS的心、脾、肾组织中的表达,提示MSC移植有望为MODS提供新的治疗方法.  相似文献
3.
GFP和Luc双标技术在小鼠肿瘤模型建立中的应用   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的建立GFP(绿色荧光蛋白)/Luc(荧光素酶)双标高效表达的人肺癌细胞系和人肝癌细胞系,利用活体成像系统观察裸小鼠肺原位移植瘤和肝原位移植瘤的生长情况。方法应用慢病毒转染的方法建立GFP/Luc双标的SPC-A-1和SMMC-7721细胞系,结合流式细胞分选技术使GFP/Luc双标表达率接近100%,分别接种于裸小鼠肺原位和肝原位,采用活体成像技术监测各稳定转染细胞在小鼠体内深部组织的表达情况。结果成功建立了GFP/Luc双标表达率接近100%的SPC-A-1-GFP/LHC和SMMC-7721-GFP/Ltic细胞系,进行裸小鼠肺原位移植和肝原位移植后,应用活体成像系统观测到裸小鼠肺原位和肝原位早期的微小病灶和晚期移植瘤的生长情况,而且,随着肿瘤移植时间的延长,移植瘤体积的增大,活体成像检测到的发光面积逐渐增大,发光强度也逐渐增加。结论所建立的稳定表达GFP/Luc的细胞系,结合活体成像技术,能够对动物模型深部的肿瘤病灶进行活体、实时、定量检测,且灵敏度极高,为进一步研究肿瘤的发生及发展提供了理想的技术手段。  相似文献
4.
绿色荧光蛋白标记的肝细胞移植治疗放射性肝损伤   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:研究移植肝细胞在放射性肝损伤动物模型体内的代谢支持作用,评价绿色荧光蛋白标记的肝细胞移植对放射性肝病(radiation-induced liver disease,RILD)的治疗效果?方法:以60Co作为放射源照射实验大鼠肝区,总剂量40 Gy,一次性照射,剂量率为100 cG/min,制成急性放射性肝损伤动物模型?4天后将所有照射动物施行部分肝叶切除术(约占2/3)?将上述动物随机分为两组,实验组经脾脏实质行Ad-EGFP感染的肝细胞移植,移植细胞数为5.0×106个,对照组经脾实质注射等量生理盐水?术后7天两组分别采血测血清清蛋白水平?术后42天再次检测清蛋白,并作常规病理切片及透射电镜检查,在荧光显微镜下观察发绿光的肝细胞的分布,比较两组在组织结构上的差异?动态观察两组生存率的变化?结果:肝细胞移植术后7天,实验组血清清蛋白水平明显上升,和对照组相比有显著差异?移植后42天,实验组血清清蛋白水平进一步升高,与对照组?5 周前的实验组水平均有显著差异?移植后42天两组动物死亡率的差异有统计学意义?组织学检查示实验组放射性肝损伤轻于对照组?结论:同种肝细胞经脾脏移植后,在放射性肝损伤动物模型体内有良好的代谢支持作用,并可提高其短期生存率?  相似文献
5.
三种方法转染绿色荧光蛋白质粒的效果评价   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
目的比较常见的真核细胞转染技术,评价采用绿色荧光蛋白为报告基因来观察细胞转染效率高低的方法。方法 分别采用磷酸钙法、电穿孔法和脂质体法将pEGFP-C1质粒转染COS-7细胞,对每种方法的转染效率及对细胞的毒性进行评价。结果脂质体法的转染率为67%,电穿孔的转染率为43%,磷酸钙法的转染率为28%。脂质体法转染对细胞的毒性最小。结论采用绿色荧光蛋白为报告基因的真核细胞转染技术中,脂质体法是效率高、安全性大的方法。  相似文献
6.
应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的 用绿色荧光蛋白(GFP)反映RNA干扰(RNAi)载体的转染率,以研究RNAi载体的抑制效果.方法 将GFP基因和RNAi片段(特异性针对Bcl-2基因)连接至pC1载体上,构建共表达载体GFP/RNAi及其对照载体,转染293细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞的GFP转染率,并用TR-PCR分析RNAi抑制Bcl-2 mRNA表达的效果.结果 在293细胞中,GFP的转染率可达85%以上,此时观察到RNAi有效的抑制了Bcl-2 mRNA的表达.结论 在RNAi实验时,可选用GFP等标记基因作为载体转染率的判断标准,以进一步判断RNAi的作用效果.构建的RNAi载体有效的抑制了Bcl-2的表达,为下一步抑制肿瘤细胞的生长提供科学资料.  相似文献
7.
CDK5基因修饰神经干细胞体系的建立和分化特性的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的建立携带CDK5与绿色荧光蛋白(GFP)的神经干细胞体系并观察CDK5对神经干细胞的作用。方法采用PCR、分子克隆与测序等技术成功构建CDK5-pEGFP表达质粒;并通过基因转染等技术将其转染入体外培养的神经干细胞中。结果(1)CDK5-pEGFP表达质粒经酶切、测序鉴定重组成功。(2)转染后神经干细胞分化24h后观察到表达CDK5的GFP荧光细胞已显示清楚的短突起,而对照组细胞的突起不明显;72h后表达CDK5的GFP细胞突起增长尤为明显,与对照组相比差异有统计学意义(P〈0.01);GFP阳性细胞体积也增大,突起明显增多、加粗。结论CDK5的表达可促进分化后神经细胞突起的生长和延长,并能加快神经细胞的形态成熟。  相似文献
8.
GFP-HPVl8 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 构建人乳头瘤病毒18型早期蛋白2(HPV18 E2)删除突变体N端(TAD)、C端(DBD)与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,为研究HPV18 E2基因与宫颈癌发生的关系提供实验基础.方法 用PCR扩增HPV18 E2 TAD、DBD基因序列,用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pEGFP-Cl载体与TAD、DBD基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定.结果 阳性克隆质粒经双酶切后,琼脂糖凝胶电泳可见4.7 kb、618 bp和243 bp附近的片段.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒分别含有618 bp与243 bp的目的基因片段,无碱基错配和移码突变,读码框完全正确.结论 成功地构建了GFP-HPV18 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1/TAD与pEGFP-C1/DBD.  相似文献
9.
将外源基因导入真核细胞的方法很多。我们通过对绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究,比较了较常用的两种方法一脂质体转染法和磷酸钙转染法。研究结果表明:脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高,且简单易行,是外源基因导人体外培养细胞内较理想的方法。  相似文献
10.
用羊金属硫蛋白(MT)启动子构建含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达载体,经脂质体介导在培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行诱导性表达。结果:构建的GFP基因表达载体能在CHO细胞中进行表达,用硫酸锌诱导可提高GFP的表达量。  相似文献
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