N,O-羧甲基壳聚糖对小白鼠精子畸形的影响

目的:观察能明显促进禽类等动物的生长发育,改善肉质的新型饲料添加剂N,O-羧甲基壳聚糖对昆明种小白鼠精子畸形的影响,分析其应用在畜牧生产中的安全性。方法:实验于2005-06-22/2005-08-06于南京农业大学动物医学院药理组实验室完成。挑选体质量25～28g的小鼠50只,以随机数字表法分为生理盐水组、环磷酰胺组、N,O-羧甲基壳聚糖(南京龙源天然多酚合成厂提供,商品名为毕罗喜,质量浓度为105g/kg)2,4,8g/kg剂量组,每组10只。N,O-羧甲基壳聚糖2,4,8g/kg剂量组分别给予相应剂量的N,O-羧甲基壳聚糖,溶于1mL生理盐水,2,4g/kg剂量1次灌服,8g/kg剂量分2次灌服,每次间隔约3h;生理盐水组给予生理盐水1mL;环磷酰胺组给予环磷酰胺0.04g/kg,溶于1mL生理盐水。给药前禁食10h,不禁水。连续灌胃5d,给药后30d麻醉下处死,取两侧附睾按Wyrobek方法涂片,观察小白鼠精子畸形状况。评估标准参照农业部兽药评审委员会办公室编写的兽药试验技术规范汇编(2001年)。评估内容参照沈建忠主编的动物毒理学(中国农业出版社,2002年),包括各种畸形的精子形态:不定形、胖头、香蕉头、无钩、双头(多头)和双尾(多尾)等,及其分类计数。每组随机选取5只小鼠,计算总畸形率。精子畸形率(%)=畸形精子总数/检查精子总数×100。结果:最终25只小鼠进入结果分析,每组5只。①环磷酰胺组的精子畸形率远高于生理盐水组和N,O-羧甲基壳聚糖2,4,8g/kg剂量组(6.10%,2.48%,2.46%,2.64%,2.78%,P<0.01);N,O-羧甲基壳聚糖2,4,8g/kg剂量组与生理盐水组比较,差异无显著性意义(P>0.05),且各剂量组之间差异也没有显著性意义(P>0.05)。②各组精子畸形主要表现为头部或尾部异常。以无定形和胖头居多,占35.48%(292/823)和29.28%(241/823);其次是无钩形及香焦形多见,占19.68%(162/823)和13.49%(111/823);偶尔可见双头双尾形,只占2.07%。结论:N,O-羧甲基壳聚糖精子畸形试验结果呈阴性,说明其对雄性生殖细胞没有明显的遗传毒性。     

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对异种移植猪肝细胞凋亡的抑制作用

目的：观察聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对猪肝细胞异种移植后移植肝细胞凋亡的抑制作用. 方法：实验于2004-03/2005-03在南通大学神经再生实验室完成,选用中国实验用小型猪（n=5）及SD大鼠（n=123）.①实验分组及方法：采用原位胶原酶循环灌注法分离猪肝细胞.D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠急性肝衰竭模型,按随机数字表法分成3组（n=41）,分别在单纯肝细胞移植组、胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组急性肝衰竭大鼠腹腔内移植震荡培养24 h的猪肝细胞悬液、Ⅰ型胶原凝胶固定培养24 h的猪肝细胞、Ⅰ型胶原凝胶包埋的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养24 h的猪肝细胞.②实验评估：观察移植肝细胞的病理变化、培养和移植肝细胞的凋亡率、坏死率及活率. 结果：①各组移植肝细胞的活率及凋亡率：纳米胶原肝细胞移植组移植肝细胞的存活时间最长.肝细胞体外培养1 d后,3组肝细胞均存在不同程度的凋亡,以单纯肝细胞移植组凋亡率最高,纳米胶原肝细胞移植组最低.胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组的移植肝细胞凋亡率随着移植时间的延长呈缓慢上升趋势,但较单纯肝细胞移植组为低;移植后1,2 d,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组的移植肝细胞活率明显高于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）;移植后3,5 d时,纳米胶原肝细胞移植组移植肝细胞凋亡率明显低于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）,活率则明显高于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）.②各组移植肝细胞的坏死率：移植后1 d,胶原肝细胞移植组移植肝细胞坏死率明显上升;移植后2 d,3组肝细胞坏死率均有不同程度的上升,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组明显高于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）,胶原肝细胞移植组高于纳米胶原肝细胞移植组（P＜0.05）.移植后3 d,单纯肝细胞移植组肝细胞坏死率大幅度上升,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组无明显变化,但显著低于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组之间差异无显著性意义（P＞0.05）.移植后5 d,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组肝细胞坏死率进一步上升,纳米胶原肝细胞移植组显著低于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）. 结论：聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子有抑制培养和移植肝细胞凋亡、提高移植肝细胞活率的作用,聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子和Ⅰ型胶原结合可增强抗培养和移植肝细胞凋亡的能力,延长移植肝细胞的生存时间.     

几丁糖对不同来源成纤维细胞分泌细胞因子的影响

目的观察几丁糖对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞分泌转化生长因子β1(TGF-β1),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),白细胞介素8(IL-8)的影响,探讨几丁糖对异常瘢痕成纤维细胞生物学活性的作用。方法以瘢痕疙瘩及增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象,正常皮肤成纤维细胞为对照,用组织块法进行不同标本成纤维细胞体外培养。用定量酶联检测试剂盒测定TGF-β1、bFGF、IL-8等。结果几丁糖对不同来源成纤维细胞分泌TGF-β1、bFGF、IL-8的能力作用不同。不同含量几丁糖作用后,TGF-β1、bFGF分泌量逐渐减少,IL-8分泌量逐渐增加。无几丁糖和相同含量下,TGF-β1、bFGF分泌量,瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组无显著差别(t=0.7,Р>0.05),两组与正常皮肤组差别显著(t=2.8,Р<0.05),3组的减少率无显著差异(t=0.5,Р>0.05)。IL-8的分泌量,无几丁糖时3组无显著差异(t=1.2,Р>0.05);不同含量几丁糖作用下,IL-8分泌量逐渐增加率无显著差异(t=0.8,Р>0.05)。结论几丁糖可抑制瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纤维细胞分泌TGF-β1、bFGF,促进其分泌IL-8,进而调节成纤维细胞的生长、增殖、合成及分泌胶原的功能。     

人骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

目的：探讨应用壳聚糖支架三维立体培养人骨髓基质干细胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)，体外诱导其分化成为软骨细胞的可行性。方法：实验于2004—02／11在中山大学附属第三医院中心实验室完成。相分离法制备三维多孔壳聚糖支架，检测支架的孔隙率、孔径。抽取人骨髓，密度梯度离心法分离纯化，体外培养扩增。将第3代MSCs复合于支架中培养，应用无血清诱导液诱导细胞向软骨细胞分化，通过组织学染色及扫描电镜观察细胞的形态、增殖及功能的改变。结果：通过相分离法可制备出高孔隙率的三维壳聚糖支架，孔隙率达86．5％，孔隙分布均匀且相互连通，平均孔径182μm。诱导分化的MSCs在支架中贴附良好，呈现典型的软骨细胞形态，并有细胞外基质分泌：结论：人MSCs在三维立体培养环境下可诱导分化为软骨细胞，作为种子细胞在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用价值。     

构建聚丙交酯-乙交酯共聚物包埋甲壳胺无纺布的新型高聚物材料支架

目的:利用聚丙交酯-乙交酯共聚物强度大和甲壳胺无纺布可塑性好的特点,制作出一种力学性能良好及空隙均匀的新型聚合物支架。方法:实验于2004-05/12在第一军医大学珠江医院全军儿科中心实验室和中山大学高分子研究所进行。将2倍甲壳胺无纺布质量的聚丙交酯-乙交酯共聚物溶解于氯仿中,聚合物浓度为20g/L,将甲壳胺无纺布反复浸泡其中、烘干,直至均匀交联。去除氯仿细胞毒后,所制作的支架,测定其力学性能及孔隙率。结果:①新型聚合物支架抗压缩强度为1.4～2.0MPa,弯曲强度达16.3MPa,剪切强度为48MPa。②新型聚合物支架孔隙率达到82%～86%,孔径在100～300μm之间。结论:使用此法制作的组织工程支架,强度和可塑性较好,三维结构稳定,各项参数可控制,可以制作较大型体积的支架。     

壳聚糖-聚乳酸复合人工硬脑膜的研制

目的:采用生物可降解材料聚乳酸和壳聚糖制作一种新型的可吸收人工硬脑膜。方法:实验于1999-06/2002-06年在华北煤炭医学院附属医院实验中心完成。实验材料主要为壳聚糖粉、聚乳酸网、质量浓度为10g/L的冰醋酸和铺膜设备。用稀酸溶解壳聚糖粉末,用特制的铺膜设备在聚乳酸网上成膜。碱、蒸馏水处理后,环氧乙烷消毒后备用。按国家有关规定的标准对人工硬脑膜进行物理性能及化学性能的测试。结果:①人工硬脑膜(湿态)物理性能测试结果:强度≥0.2N/m m,50%作负荷伸长20%不断裂,弹性恢复力82%,厚度约为(0.21±0.02)m m,耐缝性(0.32±0.08)N/m m。②人工硬脑膜化学性能测试结果:水中可溶物0.38%,易氧化物合格,酸碱度合格,灰分0.23%,重金属含量合格。结论:应用可吸收生物材料制备的人工硬脑膜,在物理性能上接近人体正常硬脑膜,能够保证手术缝合时不脱边、不撕裂,且能随颅内压的变化而有一定的弹性伸缩。其化学性能符合国家有关体内植入物的标准,可望成为一种理想的人体硬脑膜替代物。     

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的动物移植实验

背景：治疗由烧伤或疾病等引起的大面积全层皮肤缺失最为常见的和有效的方法就是皮肤移植修复，但目前面临的最大障碍是皮肤供体不足。以自体皮肤细胞作为种子细胞构建的组织工程皮肤是解决这一矛盾的最理想途径。目的：探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。设计：随机对照实验。单位：一所大学再生医学科学研究所及皮肤科。材料：实验于1998—09／2001—07在吉林大学细胞工程研究室完成。选用新生Wistar大鼠20只；8周龄雄性裸鼠24只。方法：应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(artificial skin，AS)组、壳多糖膜覆盖物(chitosan，CH)组及对照组(control gmup，CG)，术后进行大体观察，并在3，7，14和21d应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。主要观察指标：①实验动物大体观察情况。②修复区血供情况的红外热像观察。③组织学观察。结果：AS组在移植第3天，移植的组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合，有少量毛细血管长人移植物，皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近；随着时间的延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，角化现象加强，有角化物脱落；真皮层细胞数量增多，网架逐渐降解，分泌的细胞外基质成份增多；第14天，创面基本愈合；修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近，瘢痕很小，无需进行二次植皮。至移植的第14天，CH组结痂未完全脱落，创面未愈合，颜色较AS组深。对照组的结痂脱落，创面大而深。颜色深红。结论：以壳多糖为基质网架构建的组织工程皮肤具有良好的组织相容性，可应用于皮肤缺损的移植修复。     

明胶/壳聚糖创面敷料对新鲜创面收缩性的影响

目的:探讨一种透明型明胶/壳聚糖敷料对新鲜创面的收缩性的影响。方法:实验于2004-03/12在唐山市工人医院美容整形科完成。将壳聚糖溶解于适宜的稀酸溶液中,加入溶解于水的明胶,并加入一种适宜的增塑剂,充分搅拌混合,流涎法铺膜。制成明胶/壳聚糖(g/g)分别为5∶10(盐酸溶解),10∶10(分为盐酸和乳酸溶解),15∶7(盐酸溶解),明胶/壳聚糖/甘油(g/g)分别为10∶10∶4(分为盐酸和乳酸溶解),10∶10∶6(盐酸溶解)7种膜。在24只成年大鼠的背部作一新鲜创面,切至皮下组织层,面积为4cm×4cm。分别将不同制法的7种明胶/壳聚糖膜与创面自然贴附,不借助其他敷料覆盖其上。以凡士林纱布贴附为对照。每种敷料贴3只鼠创面处。黏附能力的分级在置于创面后即刻,3,4,7d测量评估:黏附面积<50%为较差,50%～69%为一般,70%～90%为良好,>90%为优秀。观察不同制法的明胶/壳聚糖膜用于新鲜创面的收缩性及抑制新鲜创面的收缩性,抑制收缩率=[创面长(mm)×创面宽(mm)/原长(mm)×原宽(mm)]×100%。结果:24只大鼠所有创面均进入结果分析。①不同制法的明胶/壳聚糖膜对新鲜创面的黏附性:0～4d明胶/壳聚糖膜黏附面积均达到优秀(>90%)和良好(75%)。7d,伤口边缘的黏附逐渐减弱,渗出物和肉芽组织的生长及动物的活动导致膜的周边与伤口分离。②不同制法的明胶/壳聚糖膜用于新鲜创面的收缩性:4h收缩为38.0～40.5mm。③不同制法的明胶/壳聚糖膜抑制新鲜创面的收缩性:7d收缩率,凡士林纱布为69.2%,乳酸溶解明胶/壳聚糖膜为85.2%,盐酸溶解明胶/壳聚糖膜为100.1%。明胶/壳聚糖膜抑制新鲜创面的收缩性效果好于凡士林纱布。结论:明胶/壳聚糖膜用于新鲜创面时,具有延缓收缩的能力。有些明胶/壳聚糖膜有轻微的收缩,是由于甘油的复脱水作用促进了收缩,用乳酸溶解壳聚糖比用盐酸溶解的膜更易导致收缩,故优选盐酸。大量渗出不利于膜对创面的贴附,为防止膜的周边与伤口过早分离,膜的周边应以透明型3M透气胶带固定。     

复合壳多糖人工皮肤组织学特征研究

目的 寻找一种能够适合临床需要的较为理想的皮肤替代物。方法 采用组织工程技术，将种子细胞接种于复合壳多糖真皮基质，先后进行沉没培养和器官型培养，观察培养物变化。结果 获得的人工皮肤有较好组织学特性和物理学特性。结论 复合壳多糖人工皮肤组织学特点接近天然皮肤，有可能成为一种新型的皮肤替代物，应用于临床。     

复合壳多糖人工皮肤移植真皮再构建的初步研究

目的：探讨复合壳多糖人工皮肤移植实验家兔后血管和基底膜的形成情况，以了解移植后真皮的再构造情况。方法：别将复合壳多糖人工皮肤移植前、移植后1个月、移植后2个月、正常人皮肤、正常兔皮肤石蜡块切片，用抗第Ⅷ因子多抗及抗层粘连蛋白多抗进行免疫组化染色，观察血管和基底膜的形成情况。结果：合壳多糖人工皮肤移植后1个月及2个月真皮内可见较多新生血管，以移植后1个月明显，且真皮浅层血管数量较正常皮肤多；部分表、真皮交界处层粘连蛋白抗体免疫组化染色阳性，可见不连续的基底膜。结论：复合壳多糖人工皮肤移植实验家兔后真皮再构建良好，是理想的组织工程皮肤材料。