自噬在结核分枝杆菌感染中的作用及相关基因的表达

目的:探讨自噬在结核分枝杆菌(MTB)感染中的作用及相关基因的表达.方法:透射电镜观察在雷帕霉素诱导下自噬体的形成,通过克隆形成单位(CFU)检测自噬形成后对胞内感染的MTB H37Rv菌株的清除作用,以实时定量PCR方法检测自噬相关基因atg5、atS7、atg8、atg12 mRNA表达水平.结果:在宙帕霉素诱导下,RAW264.7细胞可形成自噬体,自噬体产牛后对胞内感染的H37Rv菌株具有一定的清除作用.在MTB感染过程中参与自噬形成的atg5、atg8、atg12 mRNA表达量上调,而atg7表达量无变化.结论:自噬参与抗MTB免疫应答过程,而ats5、atg8、atg12是MTB感染形成自噬体的重要调控分子.     

近红外荧光染料IR-783介导的肿瘤成像

目的 评估近红外荧光染料IR-783在肿瘤中的特异性成像作用及体内安全性。方法 将IR-783染料注入SD大鼠和荷瘤裸鼠体内,分别检测IR-783的毒性和代谢周期,在此基础上,将IR-783染料注入自发肿瘤犬体内,5d后手术切除肿瘤组织,分别进行荧光成像、HE病理切片、冰冻切片荧光观察。结果 IR-783染料（0.1mmol/kg）腹腔注射SD大鼠代谢14d,脏器未见任何病理变化; IR-783（5μmol/kg）腹腔注射荷瘤裸鼠8d后,通过活体成像可以观察到移植瘤部位仍有较强的荧光。IR-783静脉注射（1.5μmol/kg）自发肿瘤犬5d后,肿瘤组织中仍可检测到较强的荧光。结论 近红外荧光染料IR-783能特异性的靶向肿瘤组织,同时具有信号稳定、无任何病理损伤等特点,具有重要的临床应用前景。     

基于胰腺癌患者来源异种移植模型的化疗药物筛选

目的 利用胰腺癌PDX 模型,评估临床化疗药物治疗效果,筛选个体化治疗方案?方法 将新鲜的胰腺癌手术标本移植裸鼠皮下,建立PDX 模型并稳定传代;利用STR 基因分型检测PDX 模型肿瘤组织的溯源性;选择临床使用的奥沙利铂?吉西他滨和伊立替康三种化疗药物进行治疗,并测量肿瘤体积;利用TGD 值数学模型方法,辅以血浆CA19 -9 检测评估三种化疗药物的治疗效果?结果 PDX 模型肿瘤组织样本的溯源性为99.99%,与原发瘤保持一致;与对照组相比,伊立替康组和吉西他滨组均具有显著的治疗效果(c =0.001),且吉西他滨抑瘤效果更为明显;伊立替康的药物毒性作用最小,吉西他滨次之?结论 成功建立胰腺癌PDX 模型并稳定传代,通过TGD 值数学模型法筛选,发现吉西他滨抑制肿瘤生长效果最为显著,推荐其作为该胰腺癌个体化治疗首选药物?     

人源性结肠癌组织异种移植模型在个体化药物治疗中的应用研究

目的 建立结肠癌人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型并研究其在化疗药物筛选中的应用价值.方法 将新鲜的人结肠癌手术标本移植于BAIB/c裸小鼠皮下建立结肠癌PDX模型,稳定传至第3代;将PDX模型肿瘤组织与人肿瘤组织H&E染色,比较其组织形态特征;免疫组织化学检测肿瘤...     

Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用

结核病(Tuberculosis,TB)主要是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的细菌感染性疾病。当宿主免疫力减弱,潜伏感染的Mtb得以复苏,导致TB感染的复发。巨噬细胞自噬作为宿主先天性和适应性免疫反应的重要组成部分,在保护宿主抗Mtb感染方面发挥着重要作用。热休克蛋白16.3(Hsp16.3)是Mtb潜伏感染(LTBI)期间表达的重要蛋白,它可能通过抑制巨噬细胞自噬而维持Mtb长期生存,从而导致LTBI的发生。本文综述了Hsp16.3在LTBI中调控巨噬细胞自噬的作用,期望Hsp16.3能够成为LTBI的生物标志物和抗结核药物的新靶点。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。     

MMP2在肿瘤侵袭和转移中的调控机制研究

肿瘤的侵袭和转移与诸多因素相关,是造成癌症病人不良预后的重要原因.肿瘤发生转移的前提条件是突破细胞外基质(ECM)这一天然屏障.基质金属蛋白酶2(MMP2)具有独特的酶活性,有突破ECM的能力,可促进肿瘤转移的发生.在多种恶性肿瘤中,MMP2通过调节多种通路影响着肿瘤的浸润、转移及预后,很可能成为一种癌症转移预测的标志...     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

人前列腺癌骨转移裸鼠移植模型的建立及其循环肿瘤细胞的特性

目的 利用裸鼠移植模型研究雄激素阻断对人前列腺癌骨转移发生的影响,并初步探索肿瘤转移过程中循环肿瘤细胞（CTCs）的生物学特性。方法 将40只裸鼠随机平分为两组,一组裸鼠手术切除睾丸以阻断雄激素的分泌,另一组为正常对照。心脏注射绿色荧光蛋白和荧光素酶双标的人前列腺癌细胞PC3-Luc-GFP,剂量为1?06/50礚/只,制备实验用骨转移模型。通过小动物活体成像系统检测人前列腺癌骨转移模型的建立;将发现转移的骨组织切片进行HE染色分析,并分离转移模型中CTCs,通过Western blot检测CTC中转移相关分子RANKL 和TOPK的表达。结果 成功建立了前列腺癌骨转移模型,切除睾丸组的骨转移发生率为2/13=15.4%,而正常对照组的骨转移发生率为5/14=35.7%,两组间有显著差别;CTCs中RANKL 和TOPK表达量均明显高于原始的前列腺癌细胞。结论 在裸鼠移植模型中阻断雄激素能显著降低前列腺癌骨转移的发生率。CTC的转移能力高于原始的前列腺癌细胞。