帕金森病相关蛋白DJ-1对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响

目的：研究帕金森病相关蛋白DJ-1对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法： Western 印迹检测骨肉瘤细胞株(MG-63,Saos-2和U2OS)及正常人成骨细胞株hFOB1.19中DJ-1和第10号染色体上缺失的 磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10,PTEN)基因的表达。DJ-1 siRNA处 理人骨肉瘤细胞后,采用Western印迹检测DJ-1的蛋白表达水平;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细 胞存活率;膜联蛋白V(annexin V)-异硫氰酸荧光素(fl uorescein isothiocyanate,FITC)/碘化吡啶(propidium iodide,PI)双染 检测细胞凋亡;Transwell侵袭和迁移实验检测细胞侵袭和迁移水平。结果：与hFOB1.19细胞比较,骨肉瘤细胞DJ-1蛋 白表达水平显著升高(均P<0.05),其中U2OS细胞升高最为显著(P<0.01)。DJ-1 siRNA可显著降低U2OS细胞中DJ-1蛋白 表达水平、降低细胞存活率、促进细胞凋亡、抑制细胞侵袭和迁移水平,以及增加PTEN蛋白表达水平(均P<0.05)。 另外,与hFOB1.19细胞比较,PTEN在骨肉瘤细胞中的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论：DJ-1可抑制人骨肉瘤 细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭和迁移水平,其机制可能与增加PTEN蛋白的表达水平有关。     

Mettl3介导m6A甲基化修饰对过氧化氢诱导的脊髓神经元氧化应激和凋亡的影响

【摘要】 目的：探讨Mettl3介导m6A甲基化修饰对过氧化氢（H2O2）诱导的脊髓神经元氧化应激和凋亡的影响。方法：分离新生（24h内）SD大鼠脊髓，经消化、离心后重悬沉淀，差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中，经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性，确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组：空白组，细胞不予任何处理，正常培养；转染对照组，细胞转染阴性对照siRNA（si-NC）；转染组，细胞转染Mettl3 siRNA（si-Mettl3）；诱导组，细胞采用300μmol/L的H2O2处理；转染对照诱导组，细胞先转染si-NC，然后采用300μmol/L H2O2处理；转染诱导组，细胞先转染si-Mettl3，然后采用300μmol/L H2O2处理。实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平，Western blot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平，免疫荧光检测Mettl3表达，酶标仪检测各组整体m6A水平，并检测白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：与空白组相比，诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高（P<0.05），Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），IL-1β（73.39±8.82ng/L vs 125.58±15.31ng/L）、IL-6（63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L）、TNF-α（103.29±12.19ng/L vs 204.37±23.65ng/L）和MDA（4.01±0.67pmol/L vs 9.23±1.05pmol/L）水平显著性升高（P<0.05），SOD（28.37±3.72U/mg vs 17.23±2.05U/mg）和GSH-Px（158.19±19.26U/mg vs 83.35±9.05U/mg）水平显著性降低（P<0.05），且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），细胞凋亡率显著升高[（8.30±0.68）% vs （34.29±3.16）%，P<0.05]；与诱导组相比，转染诱导组的m6A甲基化修饰水平显著性降低（P<0.05），Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），IL-1β（125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L）、IL-6（101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L）、TNF-α（204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L）和MDA（9.23±1.05pmol/L vs 7.28±0.96pmol/L）水平显著性降低（P<0.05），SOD（17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg）和GSH-Px（83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg）水平显著升高（P<0.05），且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），细胞凋亡率显著性降低[（34.29±3.16）% vs （23.57±2.01）%，P<0.05]。与空白组相比，转染组的炎性因子、氧化应激和凋亡水平均无显著性差异（P>0.05）。结论：H2O2可上调脊髓神经元中m6A甲基化修饰水平，并可诱导氧化应激和细胞凋亡；抑制Mettl3表达能够降低H2O2诱导的脊髓神经元m6A甲基化修饰水平，进而缓解氧化应激和细胞凋亡。     

TRPM8通过cAMP-PKA/UCP4信号调控氧糖剥夺/复糖复氧诱导的神经元凋亡

目的探究TRPM8在氧糖剥夺/复糖复氧诱导神经元PC12细胞凋亡中的分子机制。方法体外建立氧糖剥夺/复糖复氧模 型模拟脊髓缺血再灌注损伤,流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡,RT-PCR和western blot检测TRPM8、UCP4和cAMP、p-PKA、 Bax、Bcl-2 的表达变化;向PC12 细胞分别加入AMTB（TRPM8 阻断剂）和转染UCP4 质粒,western blot 检测cAMP、p-PKA、 UCP4、Bax、Bcl-2的表达水平;抑制PKA信号,检测UCP4、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平。结果氧糖剥夺/复糖复氧导致脊髓神经 元PC12 细胞发生凋亡,TRPM8 过表达,UCP4 表达下降,抑制cAMP-PKA 信号。抑制TRPM8 表达,则细胞凋亡减少, cAMP-PKA信号被激活,且UCP4的表达有所恢复。抑制TRPM8和cAMP-PKA信号,UCP4的表达减少,细胞凋亡增加。结论 在氧糖剥夺/复糖复氧模型中,PC12细胞TRPM8过表达,且通过cAMP-PKA/UCP4诱导神经元PC12细胞凋亡。     

外源性BMP9对骨肉瘤细胞MG63的影响与Wnt/β-catenin信号通路的关系

目的 研究外源性骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)过表达对骨肉瘤细胞的影响与Wnt/β-catenin信号通路的关系.方法 用携带人BMP9基因的重组腺病毒AdBMP9转染人骨肉瘤细胞MG63,上调MG63中BMP9的表达水平;MTT法检测细胞增殖能力的变化,Hochest染色法检测细胞凋亡的变化,Transwell实验检测细胞迁移能力的变化;实时定量PCR和Western blot分别检测Wnt/β-catenin信号通路中相关分子β-catenin、c-myc、cyclinD1和E-cadherin在mRNA和蛋白水平表达的变化.统计分析实验结果.结果 获得了过表达BMP9的MG63细胞;BMP9能促进MG63细胞的增殖、迁移和凋亡;MG63细胞中BMP9的过表达增强了Wnt/β-catenin信号通路中相关分子β-catenin、c-myc、cyclinD1的表达,减弱了E-cadherin的表达.结论 BMP9对于骨肉瘤细胞MG63具有正性调节作用,该调控作用可能与Wnt/β-catenin信号通路相关.     

PNKP沉默对骨肉瘤放疗的增敏作用

目的 研究多聚核苷酸激酶/磷酸酶(polynucleotide kinase/phosphatase,PNKP)在放疗诱导的细胞DNA损伤、细胞凋亡、细胞增殖和细胞周期中的调节作用.方法 将U2OS细胞系分为3组:骨肉瘤细胞对照组、阴性siRNA转染组(siC)和PNKP siRNA转染组(siPNKP).Western blot检测0、1、2、4、6、8 Gy6个剂量水平γ-射线照射后U2OS细胞中PNKP的变化,CCK-8分析不同剂量γ-射线照射后细胞的存活率,彗星实验检测辐射后骨肉瘤细胞DNA的损伤,MTT法检测辐射后细胞增殖情况,流式细胞仪分析辐射后细胞凋亡、线粒体膜电位和细胞周期的变化.结果 4 Gy剂量的γ-射线可以显著降低骨肉瘤细胞U2OS中PNKP的表达(55.17％,P＜0.01)和细胞的存活能力(与对照组相比下降50.16％,P＜0.01).与单独辐射组(siC+ IR)对比,PNKP沉默可以抑制辐照后细胞的生长(抑制率增加到129.61％,P＜0.01),增加DNA的损伤(DNA迁移量增加58.94％,P＜0.01),使细胞周期停滞在S期,促进细胞凋亡以及降低线粒体膜电位水平.结论 PNKP沉默可以增加骨肉瘤细胞放射治疗的敏感性.     

胸腺肽β4对氧化应激诱导的脊髓源性神经干/祖细胞损伤的作用及机制

目的：探讨胸腺肽β4（thymosin beta 4,Tβ4）在过氧化氢（hydrogen peroxide,H₂O₂）诱导的脊髓源性神经干/祖细胞（neural stem/progenitor cells,NSPCs）氧化应激损伤中的作用及机制。方法：分离Sprague-Dawley （SD）成年雄性大鼠中的原代NSPCs,将其分为对照组（未处理的NSPCs细胞）,H₂O₂处理组（500 μM H₂O₂损伤的NSPCs细胞）,Tβ4处理3组（H₂O₂处理组基础上分别用1、2.5、5 μg/ml Tβ4处理的NSPCs细胞）,TAK-242处理组[H₂O₂处理组基础上用Tβ4（5 μg/ml）和Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）抑制剂TAK-242处理的NSPCs细胞]。采用髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）过表达慢病毒感染NSPCs细胞,构建MyD88过表达细胞系,并经H₂O₂和Tβ4处理。qRT-PCR和Western blot检测Tβ4,TLR4,MyD88的表达水平;MTT法和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测细胞活力;采用Fluo-3/AM探针法检测细胞内Ca²⁺水平;流式细胞术和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和Caspase-9试剂盒检测细胞凋亡水平;相应试剂盒分别检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量,超氧化物歧化酶（superoxi dedismu-tase,SOD）活性和谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量。酶联免疫吸附测定法检测白细胞介素（interleukin,IL）-6和IL-1β的含量。结果：H₂O₂损伤的NSPCs中Tβ4的表达降低（P<0.05）。与H₂O₂处理组相比,Tβ4处理3组和TAK-242处理组NSPCs的细胞活力、Ca²⁺浓度显著增加（P<0.05）,LDH释放量、细胞凋亡显著减少（P<0.05）,ROS和促炎细胞因子的生成显著减少（P<0.05）,TLR4和MyD88蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。MyD88过表达后NSPCs细胞活力,SOD活性和GSH含量降低,LDH释放量、细胞凋亡显著增加（P<0.05）;而MyD88过表达后NSPCs经Tβ4处理后,细胞活力、SOD活性和GSH含量升高,LDH释放量以及细胞凋亡降低（P<0.05）。结论：Tβ4通过抑制TLR4,MyD88途径减轻H₂O₂诱导的NSPCs氧化应激、凋亡和炎症等损伤。