T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA的方法

目的：建立一种应用T7 RNA聚合酶体外转录合成大量siRNA的方法。方法：以萤火虫荧光素酶为靶标，应用T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA，脂质体转染法将其导入HepG2细胞中，通过测定荧光素酶的量，评价siRNA对萤火虫荧光素酶基因表达的抑制作用。结果：合成了以萤火虫荧光素酶为靶标的siRNA，合成的siRNA能特异性地抑制荧光素酶基因的表达，抑制率为80％。结论：建立了一种经济简便的体外合成siRNA的方法。     

雌激素上调LRP16基因表达的研究

目的：鉴定LRP16基因的表达调控途径并探讨其可能机制。方法：对LRP16基因进行启动子序列顺式作用元件和信息学角度的SAGE(serial analysis of gene expression)谱分析，提示雌激素对其可能具有转录调控作用。为证实这一作用，构建了LRP16基因启动子序列(2．6kb)调控的荧光素酶报告子(pS0)，并与雌激素受体α和β(ERα，ERβ)真核表达载体共转染COS-7和MCF-7细胞，加入雌二醇(β-E2)培养，lueiferase assay方法测定相对荧光素酶活性。结果：报告子pS0与ERα真核表达载体共转染细胞的相对荧光素酶活性较非共转染组及pS0／ERβ表达载体共转染组显著升高，并且在两种细胞中的升高幅度接近。结论：LRP16是受雌激素调控的一个新识别的靶基因，具体调控途径由雌激素变构激活的ERα直接介导，其临床意义有待进一步研究。     

以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系

目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。     

基于荧光素酶生物发光检测方法的研究及其应用进展

生物发光现象广泛存在于自然界中,不管是在陆地或是海洋都有发光生物的踪迹。其中基于荧光素酶的生物发光系统被广泛研究,启发着人类在基因、表观遗传等方面进行探索,并且开发出一系列相关的检测方法,用于体内体外各方面研究。本文从生物发光系统、荧光素酶的种类以及荧光素酶生物发光检测方法的开发与应用这几个方面进行总结,简要概括近年来基于荧光素酶生物发光检测的研究进展。     

1,25-二羟维生素D_3抑制报导载体pGL_2荧光素酶表达的研究

通过磷酸钙沉淀法将载体DNA转染Caco－2细胞。Caeo－2细胞经不同浓度1,25一二羟维生素D3处理后,测定表达的荧光素酶活性。结果;当pSG5－VDR表达载体共转染时1,25一二羟维生素D3显著地抑制Caco－2细胞荧光素酶的表达;而未使用pSG5－VDR表达载体共转染时,则无抑制作用。说明1,25一二羟维生素D3能抑制报导载体pGL2荧光素酶的表达。类似于人类PTH基因中的潜在抑制性VDRE存在于报导载体pGL2。     

维生素D_3对报告载体荧光素酶表达的作用

目的：　研究１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对结肠癌细胞系Ｃａｃｏ－２ 细胞中报告基因表达的作用,并探讨在报告载体ｐＧＬ２ 序列中存在潜在的抑制性维生素Ｄ应答元件（ＶＤＲＥ）的可能性。方法：　采用磷酸钙沉淀法将报告载体转染入Ｃａｃｏ－２ 细胞。Ｃａｃｏ－２细胞经不同浓度１,２５－二羟维生素Ｄ３ 处理后测定细胞裂解液中表达的荧光素酶活性。结果：　应用ｐＧＬ２ 报告载体时,当用ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染后,１,２５－二羟维生素Ｄ３显著地抑制Ｃａｃｏ－２ 细胞荧光素酶的表达（Ｐ＜ ０．０５）;而未使用该表达载体共转染则无抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）。应用ｐＧＬ３ 报告载体时,不同浓度的１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对ｐＬＧ３转染后Ｃａｃｏ－２ 细胞表达的荧光素酶活性均无显著抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）,该作用不依赖是否存在有ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染。结论：１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对报告载体ＰＧＬ２ 荧光素酶表达具有抑制作用,而对ｐＧＬ３ 则否;类似人类ＰＴＨ基因中的潜在抑制性ＶＤＲＥ存在于报告载体ｐＧＬ２,在ｐＧＬ３ 中该ＶＤＲＥ业已改变。     

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的 :对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)基因 5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法 :以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因 5′侧翼区 ( -14 3 1～ +84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果 :在NGAL基因 5′端 -945～ -65 8和 -65 7～ -4 172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用 ,而在 -4 16～ -15 2区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论 :在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着 2个转录增强子元件和 1个转录沉默子元件     

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法　五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果　293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论　马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。     

调控人脑胶质瘤中ezrin表达的miRNAs筛选及鉴定

目的:探讨调控人脑胶质瘤中ezrin的miRNAs筛选及鉴定。方法:针对ezrin的测序序列,在线使用Target Scan、PITA、MicroRNA.org、miRGator v2.0、miRDB等5种生物信息学软件预测分析可能调控ezrin的miRNA分子,运用荧光素酶报告载体实验检测筛选候选miRNA分子,RT-PCR检测11例胶质瘤组织和10例正常组织中候选miRNA分子mRNA的表达。结果:5种生物信息学软件预测出819个可能调控ezrin的miRNAs,根据评分结果同时结合目前国内外研究成果筛选出miR-148a、-204、-205、-34b、-370、-376b、-377、-410、-495、-548a-3p、-630和-96等12个miRNAs。双荧光素酶质粒与ezrin 3'-UTR作用位点突变体实验,证实hsa-miR-204与相应作用位点突变体EZR 204 Mutant无明显作用(P>0.05),RT-PCR结果显示miR-204在脑胶质瘤组织中的表达低于正常脑组织,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:胶质瘤组织中miR-204可通过靶向调控ezrin表达发挥生物学作用。