羊膜负载骨髓间充质干细胞与表皮细胞对放创性皮肤损伤促愈合研究

目的探讨治疗放创性全厚皮肤缺损创面的方法及效果. 方法贵州小香猪8只,每只背部脊柱两侧均有放创性全层皮肤缺损圆形创面(Ф3.67cm)各3个,共48个创面.将经处理的人羊膜(human amniotic mambrane, HAM)分别负载自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和表皮细胞,移植到其左侧24个创面作为实验组(A组);以单纯无种植细胞的HAM敷盖其右侧前16个创面(B组);以单纯油纱布敷盖其右侧后8个创面(C组).B、C作为对照组.观察移植后1～3周内各组创面愈合、肉芽组织生长及上皮化等情况,并进行创面组织HE染色及vWF免疫组织化学检测.用图像分析法测算各组各时间点创面平均面积(cm2),并计算其愈合百分率. 结果 C组于伤后 22～23天愈合,B组于伤后19～21天愈合;A组于伤后15～17天愈合,较B、C组分别提前6～7天和5～6天,愈合质量好.移植15～17天,A组与B、C组创面平均残留面积及愈合面积百分率比较,差异有统计学意义(P＜0.01). A组创面的新生上皮已完全覆盖整个创面,肉芽组织生长旺盛,肉芽组织中vWF、成纤维细胞和毛细血管含量丰富,可见胶原沉积;B、C组创面仍见许多炎性细胞浸润,肉芽组织中vWF、成纤维细胞和毛细血管含量少,胶原沉积不明显. 结论 HAM负载自体MSCs和表皮细胞植入对放创性全厚皮肤缺损创面有较好的促愈合作用,愈合质量较高.     

外周血MSCs的分离培养及对G-CSF的动员反应

目的建市多种种属外用血间充质干细胞（MSCs）的分离培养方法，探讨其对粒细胞集落刺激因子（G—CSF）的动员反应。方法用percoll（1．131g/mL）分离多种种属外周血单个核细胞，进行贴壁培养MSCs。以G-CSF作为动员剂，培养骨髓和外周血来源的MSCs，计数动员前后的成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）。结果对多种种属进行外周血MSCs分离培养，成功率不同。在本实验条件下．可以稳定的直接分离培养出大鼠外周血的MSCs。G—CSF动员后，骨髓来源MSCs的CFU-F数昔显著高于对照组（P〈0．01）；外周血来源MSCs的CFU-F数量也显著高于对照组（P〈0．01），接近4倍。结论不同种属外周血MSCs分离培养难易不同，其直接原因是生理条什下外周血中存在的MSCs量少导致的。G—CSF可以有效地动员大鼠骨髓和外周血MSCs。     

人羊膜负载猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物的实验研究

背景人羊膜为半透明的薄膜,含有多种促进细胞增殖的营养成分,是一种较好的负载角朊细胞的生物材料.目的将人羊膜负载培养猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物,并观察猪角朊细胞在人羊膜上生长增殖的形态特点.设计以细胞为研究对象,单一样本研究,重复测量观察.单位解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所.材料实验于2001-01/11在创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成.猪角朊细胞取自3月龄贵州小香猪.方法将贵州小香猪的角朊细胞原代培养,传代扩增后,将角朊细胞以1.63×105/cm2的密度接种于人羊膜基质面,逐日于倒置显微镜下观察角朊细胞的生长增殖变化情况,并于培养3 d与15 d进行光镜、电镜观察,检测角朊细胞在人羊膜上的生长情况.主要观察指标角朊细胞在人羊膜上的生长情况.结果倒置显微镜下观察接种后30 min内明显见到角朊细胞在人羊膜上黏附,24 h内大部分黏附生长,3 d形成单层完全覆盖人羊膜.光镜下人羊膜负载角朊细胞3 d,可见角朊细胞在人羊膜基质面黏附呈单层生长,细胞扁平紧密排列.扫描电镜下可见胞体呈多边形,多见胞膜突起.透射电镜下可见角朊细胞与人羊膜黏附良好,生长在人羊膜上的角朊细胞内有许多角质丝.生长至15 d,在倒置显微镜和扫描电镜下均可见,细胞因过于拥挤而隆起,因老化而形成较多碎片,部分细胞有空洞形成.结论人羊膜是角朊细胞在体外培养的良好载体,对角朊细胞有明显的促增殖作用.但人羊膜负载角朊细胞生长至15 d,因老化部分细胞有空洞形成.     

人子宫内膜细胞原代培养方法的改良

目的 寻求一种简便高效的人子宫内膜上皮细胞和间质细胞分离、纯化与鉴定方法,建立稳定的子宫内膜细胞体外培养体系.方法 简化Ryan等的子宫内膜细胞原代培养方法的取材,分离和培养条件,分离出高纯度的子宫内膜上皮细胞和间质细胞进行体外培养和传代.结果 培养成功的子宫内膜上皮细胞与间质细胞均可稳定传代,体外生长10～50 d,纯度均达90%以上.结论 该方法简便高效,可建立稳定的人子宫内膜细胞体外培养体系.     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

人源性高血糖素原基因的克隆

目的 克隆人高血糖素原基因(proglucagon cDNA,PG cDNA),构建其真核表达质粒载体.方法 从人切除脑组织中提取总RNA,并分离mRNA,经过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出PG cDNA,并将其插入经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的真核表达质粒载体pVITRO3中,构建重组质粒载体pVITRO3-PG cDNA.结果 经过限制性酶切鉴定和测序证明,PG cDNA全长543bp,编码181个氨基酸,并已插入到pVITRO3中.结论 成功获得了PG cDNA,构建了含PG cDNA 的真核表达质粒载体,为研究重组PG的功能奠定了基础.     

微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究

目的探讨微小RNA（microRNAs）分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型，Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱，转染DNA／LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究，RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型，2个分子在分化过程中均表达上调，且它们具有各自的组织分布特点；建立了以DNA／LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台；与对照组比较，抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化，说明这2个分子对于分化的进程影响不大。     

长期接触贫铀对大鼠遗传毒性的初步研究

目的研究贫铀植入/摄入3个月后对大鼠的毒性作用.方法观察大鼠精子畸形率,骨髓微核率的改变,睾丸的超微结构和病理形态学改变以及采用显性致死突变试验观察贫铀对大鼠的生殖毒性.结果植入/摄入贫铀后大鼠精子畸形率和微核率均有增加,睾丸超微结构均有不同程度的改变,而病理形态学观察则未见显著影响.植入组大鼠受孕率明显低于对照组.结论贫铀长时间暴露可对大鼠产生生殖毒性损害以及超微结构的损伤.     

烧伤后骨髓巨核细胞被噬现象机制的初步探讨

目的 初步探讨烧伤后骨髓巨核细胞被噬现象的机制.方法 采用光镜、电镜观察30%Ⅲ度烧伤后大鼠骨髓巨核细胞的形态变化,分别分离正常和30%Ⅲ度烧伤大鼠骨髓巨核细胞、中性粒细胞,采用Transwell双室培养法观察骨髓巨核细胞与中性粒细胞的游走关系.结果 30%Ⅲ度烧伤后大鼠骨髓巨核细胞部分细胞的细胞质呈局灶样坏死,部分中性粒细胞进入到巨核细胞的细胞质进行噬食,即巨核细胞被噬现象.扫描电镜显示,烧伤后巨核细胞形态不规则,表面呈现出珊瑚样的窟窿洞,而正常组的巨核细胞呈圆形,表面光滑.分离正常和烧伤后的中性粒细胞、巨核细胞分别进行双室交叉培养,发现烧伤组大鼠骨髓巨核细胞对中性粒细胞有明显的趋化作用,而正常骨髓巨核细胞对中性粒细胞的趋化作用不明显.结论 30%Ⅲ度烧伤后骨髓巨核细胞发生不同程度的损伤,且对中性粒细胞有很强的趋化作用,从而趋化后者进入损伤的巨核细胞,发生被噬现象.