双特异性磷酸酶1:炎症反应的负调控因子

炎症是机体对外界刺激的一种防御性反应,通常情况下对机体是有益的,但其失调则可导致对机体自身组织的攻击而产生病变,因此炎症反应必定要受到机体内外环境的严密调控以保证其正常进行.正常情况下,炎症刺激如病原微生物感染可激活细胞内的多条信号通路,而丝裂原激活的丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导通路是其中最为重要的一种.双特异性磷酸酶1(DUSP1,又称为MKP1)可特异性地抑制MAPK家族成员p38、JNK和ERK等的活性,是细胞中介导炎症反应的自限以及促进炎症消退的重要调控因子.     

BTB-Kelch家族蛋白KLHL32参与炎症反应调控的初步分析*

 目的：克隆人BTB-Kelch家族蛋白KLHL32编码基因并初步鉴定其在细胞中的功能。方法：采用实时荧光定量PCR分析Toll样受体5（Toll-like receptor 5,TLR5）特异性激活剂鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagllin from S. typhimurium,ST-FLA）刺激经佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）诱导分化的THP-1巨噬细胞中KLHL32 mRNA表达水平的变化,应用RT-PCR克隆人KLHL32编码区的cDNA序列并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1,采用萤光素酶双报告基因表达系统分析KLHL32过表达对转录因子核因子κB（NF-κB）活性的影响,并采用免疫共沉淀实验分析了KLHL32与Cul-3蛋白在细胞内的相互结合。结果：ST-FLA（100 μg/L）刺激经PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞4 h引起KLHL32 mRNA的表达水平下调;成功克隆了人KLHL32基因并将其克隆至真核表达载体中获得重组质粒pcDNA3.1-KLHL32-FLAG,在HEK293细胞中过表达KLHL32蛋白对TNF-α诱导的转录因子NF-κB激活没有明显影响,但KLHL32可通过其氨基端的BTB结构域与Cul-3相互结合。结论：成功鉴定了人KLHL32蛋白,其通过BTB结构域与Cul-3蛋白相互结合,可能是一种潜在的E3泛素连接酶,证实了TLR5受体激活可诱导其表达水平的下调,提示KLHL32蛋白在细胞中可能参与炎症细胞信号转导的调控。     

反义核酸——研究基因功能的有效工具

反义核酸作为新药开发的重要途径，正被广泛应用于病毒性疾病，高血压病，心血管病，白血病等疾病治疗领域药物的研究中。目前，已有不少反义核酸药物进入临床，也已有经FDA批准的新药上市。近年来，随着基因功能研究的深入和新基因的不断发展，作为基因表达抑制剂的反义核酸被越来越多地应用于与信号传导，细胞凋亡，胚胎发育等过程相关的基因功能功能的研究之中。迄今为止，已有针对诸如ICAM－1,p53,nNOS,cyclin D1,RhoA等多个基因分别应用反义核酸抑制其表达，进而确证基因功能的成功范例。随着反义技术的迅速完善，反义核酸必将在后基因组时代对基因功能的研究中发挥出更重要的作用。     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

小鼠DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定

目的 建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSPl)3’端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统,并对其进行功能鉴定.方法 提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP1 3'-UTR全长序列,酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游,获得重组载体LuDP,经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞,48h后检测双荧光素酶报告基因的表达.将含有小鼠DUSP1 3’-UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中,获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL,将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共t转染NIH3T3细胞,检测双荧光素酶的活性,分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响.结果 成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体.小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍,P＜0.01);共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍,P＜0.05),共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍,P＜0.05).结论 成功构建了DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统,该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究.     

Septin8红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的septin8红色荧光蛋白融合表达载体（pmCherry—C2／septin8），并观察其在细胞内的表达和定位情况。方法采用PCR的方法从人脑胶质细胞瘤eDNA文库中扩增获得septin8基因编码区序列，将其克隆至红色荧光蛋白载体pmCherry—C2上，重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后转染NIH3T3细胞，并利用Westernblotting和细胞免疫化学技术分析重组蛋白在细胞内的表达和定位。结果重组pmCherry—C2／septin8融合蛋白在NIH3T3细胞中得到高量表达且主要分布于细胞浆。结论成功构建了pmCherry—C2／septin8融合表达载体，该载体能在哺乳动物细胞NIH3T3中表达，为进一步研究septin8细胞内生物学功能打下了良好的基础。     

人外周血活化淋巴细胞中Survivin蛋白表达的分子机制研究

目的:探讨活化淋巴细胞中Survivin蛋白诱导表达的信号转导通路、分子级联反应和生物效应,揭示Survivin蛋白表达调控的分子机制.方法:用PHA和rhIL-2刺激培养人外周血单个核细胞,附加JAK抑制剂-AG490的处理,以Western blot检测Survivin和相关蛋白的表达;以流式细胞术(FCM)分析细胞周期和细胞分裂增殖.结果:刺激培养的细胞按照时序先后出现的分子和细胞学反应为:Stat3和Stat5磷酸化→CyclinD3、CyclinE蛋白水平上调→细胞进入S期及Survivin蛋白起始表达→细胞有丝分裂及Survivin蛋白表达水平增加.AG490对于上述反应均呈现明显的抑制作用,但对周期抑制蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平没有影响.结论:Survivin蛋白的表达依赖JAK-Stat信号转导通路的早期活化,通过上调CyclinD3和CyclinE周期蛋白水平,启动细胞周期的运行,诱导Survivin蛋白的周期时相依赖性表达,参与细胞有丝分裂与增殖.     

DNA双链断裂感应分子ATM能与PTC1相互作用

目的：研究DNA双链断裂感应分子ATM与原癌基因ret重排活化蛋白PTC1的相互作用。方法：用Flag抗体Western印迹检测，ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的PTC1；RET抗体检测ATM免疫共沉淀真核细胞内过表达的c-ret;用HA／myc抗体Western印迹检测，HA－ret TK myc-LZPR免疫共沉淀蛋白复合物；荧光蛋白标记的亚细胞定位。结果：PTC1可以与ATM激酶相互作用，此作用不依赖于电离辐射，且不被PI3K家族特异性抑制剂沃氏蓝霉素（wortmannin)所抑制，而野生型RET蛋白则不能同ATM结合；缺失体实验进一步证明两者的结合区段为ATM的LZPR结构域与PTC1的酪氨酸激酶结构域，构建PTC1绿色荧光蛋白表达质粒的亚细胞定位实验显示，PTC1以弥散形式分布于细胞质内。结论：胞浆蛋白PTC1可能借债某种途径使ATM在DNA损伤反应发生后重新定位，介导了细胞的恶性转化机制。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导HeLa细胞p21WAF1/CIP1表达的分子机制研究

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDIs）诱导肿瘤细胞产生周期阻滞以及诱导p21^WAF1／CIP1表达的分子机制。方法：以人宫颈癌HeLa细胞为模型，用曲古抑茵素A（TSA）处理HeLa细胞，通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡，通过Western印迹及RT-PCR检测周期相关分子的蛋白及mRNA的表达；并构建TSA靶分子启动子区的荧光素酶报告质粒，进一步检测TSA的主要作用位点，寻找相关作用途径。结果与结论：TSA可诱导HeLa细胞发生周期阻滞，并呈现明显的剂量和时间依赖关系，加大用药剂量及延长用药时间可诱导凋亡。TSA可显著诱导p21^WAF1／CIP1的表达，表现为转录水平的调节，其变化可以指示周期阻滞的程度。p21^WAF1／CIP1启动子区3′端是TSA作用的主要位点，同样被TSA诱导表达增加的p53很可能通过与其效应元件的结合而使TSA诱导p21^WAF1／CIP1表达的总效果增强。