应用荧光探针H2DCF-DA检测光照致细胞内活性氧产生的初步研究

目的应用荧光显微镜及新型荧光探针H2DCF-DA检测在光源照射过程中人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)内活性氧的产生情况。方法将ECV304细胞接种于35mm培养皿中,24h后加入H2DCF-DA,使其终浓度为10μmol/L,孵育30min。利用荧光显微镜的激发光源作为照射光源,在采集荧光图像的同时完成光源照射,光源输出波长范围为460～490nm,功率密度约为100mW/cm2。连续采集DCF的荧光图,观察细胞内DCF荧光的变化情况,采用计算机图像处理和分析技术,求得细胞内不同照射时间点DCF平均荧光强度,进而得到平均荧光强度-时间曲线。另外,使用线粒体特异标记探针MitoFluorRed589与H2DCF-DA共同孵育细胞,分别采集同一细胞的DCF的荧光图和MitoFluorRed589的荧光图,并利用像素-荧光强度分析方法来确定DCF荧光在细胞内的分布位置。结果在光源照射的开始阶段,ECV304细胞内的DCF荧光强度迅速增加,在第10s时便上升至第2s时的2.2倍,但是随着照射时间逐渐延长,荧光强度增幅逐渐变小,到第60s时上升至第2s时的4.7倍。观察时间进一步延长,DCF的荧光强度的变化似乎进入平台期,继而开始出现下降。考察DCF荧光在ECV304细胞内的分布位置主要通过比较细胞内不同区域的I1/I2值,通过图像分析与计算得到线粒体区、细胞核区以及细胞质非线粒体区内I1/I2值分     

激光共聚焦显微成像技术对亚细胞位点光动力损伤的动态观察

目的探讨应用激光共聚焦显微成像技术对光动力效应所致亚细胞位点损伤进行动态观察的可行性。方法实验分为HMME＋Rhodamine-123组、单加HMME组、单加Rhodamine-123组和单纯细胞组，后3组作为对照组。传代培养鼠肺毛细血管内皮细胞，将血卟啉单甲醚（HMME）与内皮细胞共同孵育24h后，加入细胞探针Rhodamine-123对线粒体进行染色。应用激光共聚焦显微镜并采用细胞器-细胞荧光强度比值法对HMME进行亚细胞定位，随后采集Rhodamine-123的荧光图像动态序列。结果HMME＋Rhodamine-123组的Rhodamine-123荧光图像在光照过程中逐渐发生变化：典型的线粒体形态特征逐渐消失，并伴有荧光强度下降，荧光在胞浆内趋于弥散分布，细胞核内出现Rhodamine-123的荧光；而单加Rhodamine-123组的Rhodamine-123荧光图像未发生明显变化。结论应用激光共聚焦显微成像技术能实现亚细胞水平光敏损伤位点的动态光学检测，线粒体和核膜可能是HMME介导的光动力损伤亚细胞位点。     

光敏剂亚细胞定位研究方法的应用比较

目的 探讨不同光敏剂亚细胞定位方法的应用特点。方法 应用电感耦合器材（CCD）荧光显微成像系统，选择细胞器荧光探针BODIPY标记细胞内高尔基体。分别采用直接观察法、伪彩色融合法、波形比较法、相关系数法及细胞器一细胞荧光强度比值法，对光敏剂血卟啉单甲醚（HMME）进行细胞内分布的定性与定量研究。结果 采用直接观察法比较光敏剂和细胞器探针荧光图像，发现HMME和BODIPY的荧光分布模式有相似之处，采用伪彩色融合法得到的二者融合图像，显示存在黄色的空间重叠区域。应用波形比较法发现，直线路径上所有像素在HMME荧光图像与BODIPY荧光图像中的灰度值相对空间坐标的曲线波形相似。应用相关系数法得出，各像素的HMME荧光灰度值与细胞器探针荧光灰度值之间的相关系数值为0．6024。采用细胞器一细胞荧光强度比值法发现，随着参数m的增大，即细胞器聚集程度的降低，高尔基体聚集区域的平均荧光强度比值（J1／J2）呈下降趋势，二者具有明显的相关性（P〈0．05）。结论 通过直接观察、伪彩色融合及波形比较的方法，基本可以判定HMME在高尔基体聚集区域有分布；采用相关系数法．尤其是细胞器一细胞荧光强度比值法能得到更为精确的量化结果，以弥补定性方法的不足。     

两种荧光显微成像系统亚细胞定位的对比

目的:应用高分辨率荧光显微成像系统采集细胞器探针图像,并与激光共聚焦显微成像系统进行对比。方法:实验于2003-05/2004-01在解放军总医院完成。①实验材料:鼠肺毛细血管内皮细胞株(1H11)由上海复旦张江生物公司提供;荧光探针Rhodamine-123,Lucifer Yellow,DiOC6[3],BODIPY(美国Sigma公司)。②细胞培养及荧光探针染色:细胞培养采用含体积分数为0.2胎牛血清的低糖DMEM培养基,密度5×107L-1。选择Rhodamine-123作为细胞线粒体特异性荧光探针,选择DiOC6[3]作为细胞内质网特异性荧光探针,选择BODIPY作为细胞高尔基体特异性荧光探针,选择Lucifer Yellow作为细胞溶酶体探针。前3个探针在完全避光条件下与培养的细胞共同孵育0.5h,后者则共同孵育15h。③高分辨率荧光成像系统的图像采集:线粒体荧光图像采集,选取经Rhodamine-123共孵育完成的细胞,选择激发滤色镜为BP460-490,吸收滤色镜为BA515,分光镜为DM500,另加一绿通道液晶滤光片,激发出Rhodamine-123的荧光。电荷耦合器件采集图像并送入计算机。重复上述步骤,采用DiOC6[3]标记内质网,BODIPY标记高尔基体,Lucifer Yellow标记细胞溶酶体,激发条件同Rhodamine-123。分别采集同一视野靶细胞DiOC6[3]、BODIPY或Lucifer Yellow的荧光图像,完成全部图像采集并储存在计算机中。④激光共聚焦显微成像系统的图像采集:选择经4种探针染色的靶细胞,使用氩离子激光器在488nm激发Rhodamine-123,Rhodamine-123荧光通过配置有530/60-G发射滤光片的通道1探测。重复上述步骤,在488nm激发DiOC6[3]和BODIPY,在457nm激发Lucifer yellow,3种荧光均由通道1探测,后2个探针的发射滤光片的配置为515/30-G,DiOC6[3]选择530/60-G。由光电倍增管接收信号并传输入计算机成像。结果:①高分辨率荧光成像系统所采集图像,靶细胞中由荧光探针Rhodamine-123染色的线粒体呈多个典型的小棒状或卵圆状,聚集在核周;Lucifer yellow染色的溶酶体呈多个非对称球型,在胞浆内随机分布,颗粒尺寸通常大于线粒体;荧光探针DiOC6[3]着色的内质网占据胞浆的很大空间,以囊状聚集为特征;BODIPY特异性地结合在高尔基体上,荧光图像显示围绕在细胞核周围呈条索状。②与高分辨率荧光成像系统比较,激光共聚焦显微成像系统所采集的图像其荧光强度基本相同,但分辨率低、细节显示模糊、胞浆中细胞器的准确分布信息和形态特征显示效果欠佳。结论:两种荧光显微成像系统均可采集到细胞器探针的荧光图像。但高分辨率荧光成像系统采集的荧光图像具有细节清晰、分辨度高、准确显示胞浆中细胞器的分布信息和形态特征等优点。     

应用定量分析法与图像观察法对光敏剂细胞内分布的对比研究

目的 探讨定量分析法在光敏剂亚细胞定位研究中的应用特点,并与图像观察法进行比较. 方法 传代培养A549肺癌细胞,分别与光敏剂血卟啉单甲醚孵共同孵育2,12,24 h.选择四种特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、Lucifer yellow、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体,倒置荧光显微镜和致冷CCD探测HMME和探针荧光图像.观察细胞中光敏剂和荧光探针各自的荧光图像并分析光敏剂在细胞中的分布特点.定量计算探针荧光高强度区域与细胞区域内的HMME荧光均量比IB/IA. 结果 图像观察法显示,孵育2,12,24 h,细胞内HMME几乎不进入细胞核,而主要弥散分布于细胞质及各细胞器.定量结果显示: A549肺癌细胞内,2 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、线粒体、内质网;12 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体;24 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、内质网、溶酶体、线粒体;高尔基体组IB/IA随时间上升. 结论 应用定量分析法较图像观察法更可以准确反映出HMME在细胞内分布随着孵育时间变化的特点.     

血卟啉单甲醚蛋白结合状态对其亚细胞分布的影响

目的探讨在不同种类血浆蛋白的条件下血卟啉单甲醚向细胞内转运及分布的特点.方法在不同种类血浆蛋白条件下,将血卟啉单甲醚(HMME)与传代培养HeLa细胞共同孵育2 h和12 h.采用荧光探针标记技术和细胞器-细胞荧光强度比值分析法对细胞内HMME进行亚细胞定位和定量分析.结果孵育2 h与12 h比较,不含血清组中4种细胞器内HMME的平均荧光光强比值都有升高,以线粒体、内质网和高尔基体较显著,溶酶体稍有升高;白蛋白(Alb)组中4种细胞器中溶酶体的HMME平均荧光光强比值升高较显著,其他3种细胞器则略有升高;低密度脂蛋白(LDL)组中4种细胞器中溶酶体内HMME的平均荧光光强比值升高更加显著,其他细胞器的HMME平均荧光光强比值升高幅度明显大于Alb组.结论在短时间内进入细胞的主要为游离型HMME,转运形式以单纯被动扩散为主,以高尔基体、线粒体和内质网等细胞器为主要分布位点,溶酶体次之.随着孵育时间的延长,HMME可以和白蛋白、低密度脂蛋白结合形成结合型HMME,以胞吞形式进入细胞,二者相比,和LDL结合的HMME更易穿过细胞膜,溶酶体吸收HMME能力增强.     

荷瘤大鼠射频消融治疗前、后白细胞介素-10表达水平的变化及其意义

目的探讨射频消融（RFA）治疗肝肿瘤大鼠后，其外周血、肝脏局部组织、脾脏组织内白细胞介素-10（IL-10）水平的变化及其意义。 方法取30只Sprague-Dawley大鼠，制作肝肿瘤模型，随机分为RFA后1周组、RFA后2周组和对照组，每组10只。前2组分别于RFA处理后1周及2周处死，对照组不做RFA处理即处死。取射频灶周边（对照组取肿瘤周边）0.5 cm范围内肝、脾组织及外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞，应用流式细胞术检测IL-10表达水平。 结果对照组大鼠肿瘤周边肝组织IL-10水平为（89.47±3.70），RFA后1周组为（81.62±10.19），RFA后2周组为（84.20±9.96），RFA后1周组与对照组比较差异有统计学意义；对照组大鼠脾脏组织IL-10水平为（96.32±0.89），RFA后1周组为（92.70±2.27），RFA后2周组为（96.34±0.97），RFA后1周组与对照组比较差异有统计学意义；对照组大鼠外周血IL-10水平为（95.92±2.31），RFA后1周组为（89.71±5.44），RFA后2周组为（87.67±11.11），RFA后1周组与对照组比较差异有统计学意义。 结论RFA通过对肿瘤组织的原位灭活，在一定程度上解除肿瘤组织所释放的IL-10对荷瘤宿主的免疫抑制状态，削弱IL-10对机体抗肿瘤免疫应答，包括对机体及肿瘤局部树突状细胞分化成熟的抑制作用。     

肝脏射频消融对大鼠外周血单个核细胞OX62，OX6及CD86表达的影响

背景：既往已有研究证实经皮射频消融在有效灭活肿瘤的同时,能够在一定程度上改善机体免疫抑制状态。抗原呈递细胞在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用,树突状细胞是目前所知机体内功能最强的专职性抗原提呈细胞。 目的：观察肝脏射频消融后大鼠外周血单个核细胞OX-62,OX-6和CD86的表达变化。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-06/2006-03在北京大学临床肿瘤学院完成。 材料：选用SD大鼠12只,按随机数字表法分为2组,对照组和射频后1周组各6只。 方法：对照组大鼠处死后抽取外周血2 mL。将射频后1周组大鼠肝脏左叶牵出,斜置电极针入肝,展开电极针,射频作用时间 4 min。射频完毕给予抗感染治疗,射频治疗后1周处死后抽取外周血。 主要观察指标：①正常鼠肝射频后大体和病理学改变。②射频前后外周血内单个核细胞OX-62,OX-6以及CD86表达水平。 结果：鼠肝组织射频灶病理组织学检查显示从中心到外围呈凝固性坏死-细胞变性-肉芽组织形成的演变特点。射频后1周组大鼠外周血单个核细胞中树突状细胞特异性标志OX-62的阳性表达率为(0.70±0.16)%,显著高于对照组[(0.34±0.08)%,P < 0.05]。2组大鼠外周血树突状细胞中OX-6,CD86的阳性表达率差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：射频消融可促进大鼠外周血中树突状细胞前体细胞数量增多,可能会对提高机体在免疫应答中的抗原提呈能力起到促进作用。     

荷瘤大鼠射频消融治疗前后血清VEGF表达水平的变化及意义

,RFA后1周组及RFA后2周组与对照组比较差异均有统计学意义.结论 RFA通过对肿瘤组织的原位灭活在一定程度上解除肿瘤组织所释放的VEGF对荷瘤宿主的免疫抑制状态,促进荷瘤宿主体内树突状细胞(dendritic cells,DC)的分化成熟,提高机体抗原提呈能力.