整合子与细菌耐药相关性研究进展

整合子是近年来被发现的一种新的遗传结构元件,能够识别外界的耐药基因,可以通过位点特异性重组的方式捕获耐药基因并使其表达;也可以位于质粒或转座子上,作为质粒或转座子的一个组成部分,在转移的过程中使耐药基因在细菌中发生播散。整合子因为与细菌耐药性的产生和传播关系密切而备受各方的关注。     

高敏肌钙蛋白Ⅰ、同型半胱氨酸、炎症因子在急性加重期慢性阻塞性肺疾病中的诊断价值

目的探讨高敏肌钙蛋白Ⅰ(hs-cTnI)、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)检测在慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)的诊断价值。方法收集AECOPD患者96例,以50例体检健康者为健康对照组,采用电化学发光法测定hs-cTnI水平、循环酶法测定Hcy水平、免疫比浊法测定hs-CRP水平、胶体金印迹法测定PCT水平,相关性分析采用Pearson相关分析,分析各指标与AECOPD之间的相关性、利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析hs-cTnI、Hcy、hs-CRP、PCT诊断COPE急性加重期的曲线下面积(AUC)。结果 AECOPD组hs-cTnI、hs-CRP和PCT水平均高于健康对照组,差异有统计学意义(P0.05),AECOPD组Hcy水平低于健康对照组,差异无统计学意义(P0.05);Pearson相关性分析中,hscTnI、hs-CRP和PCT水平与AECOPD呈正相关(r分别为0.346、0.401、0.509),Hcy水平与AECOPD相关性较差(r=0.078);ROC分析中,hs-cTnI、hs-CRP和PCT的AUC分别为0.825、0.834、0.922,最佳诊断界值分别为0.082、18.25、3.075,灵敏度分别为0.823、0.802、0.781,特异度分别为0.92、0.62、0.94,约登指数分别为0.743、0.422、0.721,kappa值分别为:0.699、0.423、0.664。结论 Hcy检测对AECOPD诊断价值低,hscTnI、hs-CRP和PCT检测在AECOPD具有一定的诊断价值,可作为AECOPD的辅助诊断指标。     

泛耐药肺炎克雷伯菌株的医院内流行特性的研究

目的 了解华山医院泛耐药肺炎克雷伯菌株及其流行的特点.方法 收集2006年8月-2009年12月对CLSI推荐常规检测药物均耐药的肺炎克雷们菌临床分离株,共57株.所有菌株都进行药物敏感试验、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)初筛及表型确证试验、改良Hodge试验、等电聚焦电泳,聚合酶链反应及其产物测序、接合试验、肠杆菌基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)和多位点序列分型(MLST).结果 所有菌株都携带blaKPC-2、blaCTX-M-14、blaSHV12和blaTEM-1及qnrB和aac(6')-I b-cr基因.57株细菌中ST423型5株,MIST ST11型52株.ST423型散发,而ST11型呈医院内流行.57株细菌都对替加环素耐药,对多黏菌素、米诺环素和多西环素部分敏感.结论 本次泛耐药肺炎克雷们流行主要为ST11型菌株;不同的肺炎克雷伯菌株,播散能力不同;检出泛耐药肺炎克雷伯菌时应增加检测药物的种类.     

1550例血培养阳性报警时间与分离菌种类分布的分析

目的了解血培养阳性报警时间与分离菌种类的关系。方法对浙江省人民医院2005年1月-2009年12月1550例血培养阳性标本的分离菌株进行回顾性统计分析,对其中的461株可能污染菌与临床资料进行综合分析。结果 1550株阳性分离菌中,<18 h检出566株,检出率为36.5%,19~24 h检出336株,检出率为21.6%,25~48 h检出550株,检出率为35.5%;461株可能的污染菌与临床资料综合分析后确认其中的253株为污染菌,污染率为16.5%;45株不能确定,另163株为致病菌,阳性报警时间在19~24 h的有31株为污染菌,阳性报警时间在25~48 h的有137株是污染菌,阳性报警时间>48 h的98株中有85株为污染菌。结论血培养阳性报警时间结合临床资料可以初步明确分离菌是致病菌或是污染菌。     

医学实验室认可进程中分析前过程的流程优化与监控

目的探讨医学实验室认可进程中分析前过程的流程优化方式和监控对策,以提升管理效率,确保检验质量。方法依据CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可准则》(ISO 15189:2012),充分利用实验室内审机制,逐一对分析前过程的各个环节进行分析,找出问题,分析问题,采取有效措施整改并评估优化效果。结果分析前过程各环节进行技术优化和管理优化后,与其相关的关键质量指标均有明显改善,医生和患者满意度均有所提升。结论 ISO 15189:2012认可进程中结合认可体系对分析前过程进行流程优化和流程监控,有助于提升医学实验室的管理效率,保障检验质量,提高医患满意度。     

整合子中氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶多克隆抗体的制备与初步应用

目的 制备氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶[AAD(3″)]特异性抗血清,并探讨其在检测第1类整合子8种不同可变区启动子(PcS、PcH2、PcH1、PcW、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 -P2和PcW-P2)下游基因盒中aadA2基因表达水平的应用价值.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增aadA2基因,并克隆至表达载体pET19b中,诱导表达并纯化带组氨酸标签的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔制备抗AAD(3″)特异性抗血清.以制备的抗AAD(3″)抗血清为一抗,用免疫印迹法(WB)检测不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的翻译水平,用微量肉汤稀释法检测链霉素对含不同可变区启动子及其下游aadA2基因盒的大肠埃希菌JM109的最低抑菌浓度(MIC).结果 成功构建重组的AAD(3″)蛋白表达质粒pET1 9b-aadA2,经测序确认转化大肠埃希菌BL21( DE3)获得1株高表达可溶性重组AAD(3″)蛋白的工程菌株,发酵后用镍柱纯化获得纯度＞90％的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得效价＞ 1∶100 000的抗AAD(3″)特异性抗血清.WB检测8种不同可变区启动子下游aadA2基因翻译产物AAD(3″)蛋白的表达水平,设定启动子PcW下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平为1,重复3次测得启动子PcS、PcH2、PcH1、PcS-P2、PcH2 -P2、PcH1-P2及PcW-P2下游AAD(3″)蛋白相对表达水平依次为12.9±2.3、9.1±1.0、2.0±0.4、16.0±1.3、14.1±1.3、10.5±0.7、8.9±1.7,且不同可变区启动子下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平差异具有统计学意义(F=32.421,P＜0.01).微量肉汤稀释法重复3次测得链霉素对含启动子PcS、PeH2、PcH1、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 P2、PcW、PcW-P2及其下游aadA2基因重组质粒的大肠杆菌JM109的MIC平均值依次为256、256、64、128、32、128、4、64 mg/L,表明不同可变区启动子下游aadA2基因的表达水平不同可赋予宿主细菌对链霉素产生不同水平的耐药.结论 成功纯化出可溶性重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得高效价的抗AAD(3″)特异性抗血清,为进一步研究整合子中整合酶基因与可变区基因盒表达之间的相互关系奠定基础.不同可变区启动子下游耐药基因盒的表达水平明显不同,赋予宿主细菌对相应抗菌药物的耐药水平明显不同,因此在对临床菌株进行第1类整合子分子流行病学调查时,应重视可变区启动子分类方面的研究.     

利用EZ-Tn5转座子插入突变探索细菌基因组中影响其耐药性变化的因素

目的研究细菌基因组中影响抗菌药物活性的因素。方法用EZ-Tn5转座复合物通过电转化,随机插入大肠埃希菌BL21细菌染色体基因组,获得BL21菌株的插入突变文库;对所有突变克隆株进行37种抗菌药物体外药敏试验;耐药性发生明显恒定改变的菌株进行反向PCR,并对产物进行测序和序列分析,确定转座子插入的确切位点;结合被灭活基因的表达功能推测耐药性改变的原因。结果确定大肠埃希菌电转化最佳条件为菌液OD值为0.8(600 nm)时进行感受态制备,10%甘油缓冲体系和2.7 V电击电压;共得到182株成功插入Tn5转座子的克隆,建立大肠埃希菌BL21菌株随机插入突变文库,其中插入突变菌株BLmu29对青霉素、头孢唑林、头孢克洛、头孢丙烯等抗菌药物的敏感性增加,其中以对青霉素的变化最为明显,抑菌圈直径从对照菌株的12 mm扩大到17 mm;对其进行反向PCR,并对PCR产物测序证实插入转座子的位点为1736,其灭活的基因为甘油-3-磷酸酰基转移酶。结论灭活大肠埃希菌基因组中甘油-3-磷酸酰基转移酶所对应基因,使对细菌对青霉素等亲水性抗菌药物的耐药表型发生改变,提示此基因可影响大肠埃希菌对于亲水性抗菌药物的耐药性。     

利用表型筛选法测定整合子对耐药性基因盒的整合频率

目的 建立一种利用表型筛选的方法来测定整合子对耐药性基因盒的整合频率. 方法 将整合子和aadA2耐药性基因盒克隆到同一质粒pACYCl84的不同位点,该重组质粒和高表达整合酶的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),挑选阳性克隆过夜培养后,取适量菌液涂布含有链霉素的LB琼脂平板,同时取适量菌液涂布不含链霉素的LB琼脂平板,过夜培养后计数菌落个数,用以计算整合频率.同时以链霉素平板上的阳性克隆为模板,进行PCR扩增.对扩增产物切胶回收纯化,然后进行测序,以确定aadA2耐药性基因盒整合位点. 结果 在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中,整合子对aadA2耐药性基因盒的整合频率为1.1×103,主要的整合位点为attI. 结论 该系统可以用于整合子对基因盒捕获频率的测定.     

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌第1类整合子可变区启动子检测及同源性分析北大核心CSCD

目的了解医院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CR-PA)中第1类整合子可变区启动子的种类和排列方式,分析其与介导的耐药基因表达之间的关系;并明确整合子阳性菌株的同源性情况。方法运用聚合酶链反应(PCR)、琼脂糖凝胶电泳以及测序的方法,以2012-2014年医院临床分离42株第1类整合子阳性CR-PA为对象,检测其可变区启动子和同源性。结果 42株实验菌株中强启动子PcS为2株、弱启动子PcW为2株,剩余38例皆为杂合1型启动子PcH1;位于Pc下游的P2启动子42例皆为-35到-10区间隔有14个碱基序列的无活性型的启动子;42株CR-PA经肠杆菌基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)基因分型,主要分为A、B、C、D、E 5型,其中A1型32株,A2型6株,B、C、D和E型各为1株,A型菌株主要是来源于ICU及神经外科。结论本地区临床分离CR-PA中第1类整合子可变区的启动子主要以杂合1型启动子PcH1为主,P2启动子全为无活性型;整合子阳性菌株的基因分型间呈现高度的同源性,可能存在着医院的克隆传播。     

细菌整合子研究进展

整合子是近年来在细菌中发现的一种可移动性基因元件，通过位点特异性重组捕获并表达外源性基因盒，是导致耐药基因在细菌间水平播散的重要原因。本文就整合子的发现、结构、分类；基因盒的结构、来源；整合子对基因盒的捕获、剪切与表达；整合子与细菌耐药性的关系以及整合子的检测等方面进行综述。