恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的　构建恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)CSP3′末端基因的原核表达载体 ,并对CSP3′末端基因进行序列测定。方法　根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物 ,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因 ,将其克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,转化大肠杆菌JM10 9;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因 ,其片段大小为 2 2 5bp ,构建的阳性重组质粒pGEX 4T 1 CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致 ,测序结果进一步确认了插入片段的正确性。　结论　成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒 ,为进一步研究其功能奠定了基础。     

阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因cap2037的克隆与表达

目的对阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因的克隆与原核表达。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TvV—T1序列设计一对引物，经RT—PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析，再将其克隆至表达载体pET28a。并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果目的基因片段长度为2037bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的同源性最高为82．9％，构建原核表达载体pET—Cap2037；IPTG诱导后，SDS—PAGE显示表达产物的大小约75kDa。结论成功克隆出阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因序列，与TVV—T1株序列有82．9％的同源性，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，75kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达。     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-PELP1的构建及其在人牙周膜干细胞中的表达

目的 克隆人源脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-,glutanic acid-,leucine-rich proteinl,PELP1)基因全长,构建PELP1基因全长过表达载体,研究PELP1基因表达特点,为PELP1基因在不同组织细胞中的功能性研究奠定基础.方法 采用反转录PCR法从MCF-7细胞总RNA中克隆PELP1基因全长,与含有EcoR I与Xho I双酶切位点的真核过表达载体pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-PELP1.经双酶切及测序鉴定重组质粒中PELP1基因的完整性及正确性.运用脂质体将重组质粒转染至人牙周膜干细胞中,运用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及蛋白质印迹法分别从基因和蛋白水平对转染细胞中PELP1的表达进行检测.结果 成功克隆出PELP1基因全长,并将其插入至pIRES2-EGFP过表达载体中,经双酶切鉴定和测序鉴定证实目的质粒片段插入无误.重组质粒pIRES2-EGFP-PELP1转染48 h后PELP1基因水平是转染空质粒人牙周膜干细胞的(148.0±1.3)倍,二者差异有统计学意义(P＜ 0.005).蛋白质印迹法结果显示,与转入pIRES2-EGFP的人牙周膜干细胞中PELP1蛋白相对表达量(0.3300±0.0117)相比,转入pIRES2-EGFP-PELP1重组质粒的人牙周膜干细胞中PELP1蛋白相对表达量(0.6200 ±0.0045)显著增高,二者差异有统计学意义(P＜ 0.005).结论 本项研究成功运用qRT-PCR反应从MCF-7细胞中克隆出PELP1全长基因,并成功构建pIRES2-EGFP-PELP1真核过表达载体.     

我国细粒棘球蚴新疆分离株AgB亚基基因克隆及序列分析

目的 对我国细粒棘球蚴新疆分离株AgB亚基基因进行克隆、测序,对序列进行遗传变异性分析.方法 根据参考文献设计特异性引物,从新疆源细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节中提取总RNA,通过RT-PCR扩增目的基因片段并克隆入TA载体中测序.用Bioedit分析软件和Blastn和clusterW2等在线分析系统对序列进行分析.结果 从细粒棘球蚴中克隆获得AgB抗原的3个亚单位基因,经测序确定为正确的目的序列;序列比对分析表明,3个亚单位基因的核苷酸序列一致性为43％ ～ 60％,氨基酸序列一致性为30％ ～ 42％.结论 EgAgB的亚单位基因变异性较大.     

Back to BAC: the use of infectious clone technologies for viral mutagenesis

Bacterial artificial chromosome (BAC) vectors were first developed to facilitate the propagation and manipulation of large DNA fragments in molecular biology studies for uses such as genome sequencing projects and genetic disease models. To facilitate these studies, methodologies have been developed to introduce specific mutations that can be directly applied to the mutagenesis of infectious clones (icBAC) using BAC technologies. This has resulted in rapid identification of gene function and expression at unprecedented rates. Here we review the major developments in BAC mutagenesis in vitro. This review summarises the technologies used to construct and introduce mutations into herpesvirus icBAC. It also explores developing technologies likely to provide the next leap in understanding these important viruses.     

肺炎衣原体假定蛋白Cpn0146的定位及其生物信息学分析

目的：对肺炎衣原体假定蛋白Cpn0146进行定位与生物信息学分析。方法：使用PCR方法从肺炎衣原体菌株AR39基因组中扩增Cpn0146,并将其插入到pGEX-6P2构建表达质粒pGEX-6p2-Cpn0146并转化大肠杆菌XL-Blue,IPTG诱导其表达融合蛋白GST-Cpn0146。纯化后的融合蛋白免疫小鼠制备特异性抗体,并应用间接免疫荧光法对肺炎衣原体的Cpn0146进行定位分析,最后利用软件Expasy和antheprot5.0对Cpn0146进行生物信息学分析。结果：成功构建了表达载体pGEX-6p2-Cpn0146和制备了抗Cpn0146的多克隆抗体。间接免疫荧光实验显示Cpn0146位于肺炎衣原体的包涵体膜上。生物信息学分析显示Cpn0146具有较好的亲水性与抗原性。结论：肺炎衣原体假定蛋白Cpn0146为一包涵体膜蛋白,其抗原性和亲水性较好。     

人细小病毒B19非结构基因ns1和7.5ku蛋白基因的克隆与表达

目的通过分子克隆技术,构建人细小病毒B19非结构基因ns1和7.5kugene的原核表达载体,并诱导重组NS1和7.5ku融合蛋白的表达,为蛋白的纯化奠定基础。方法以含有B19病毒全基因组感染性克隆为模板,用PCR法扩增目的基因ns1和7.5kugene,以pET-28a为表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ns1和pET28a-7.5ku,转化E.coliBL21(DE3),获得重组工程菌株。经IPTG诱导培养6h后,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。结果成功构建了pET28a-ns1和pET28a-7.5ku,IPTG诱导能获得较高的目的蛋白。结论人细小病毒B19的非结构基因能在大肠埃希菌中获得成功的表达,为蛋白的纯化和抗体制备奠定基础。