膝关节周围恶性骨肿瘤保肢术后的肢体功能康复

目的总结股骨下端、胫骨上端恶性骨肿瘤患者保肢手术后膝关节功能康复方法。方法64例恶性骨肿瘤患者接受不同方式的保肢手术治疗,平均随访36.8个月。结果(1)术后早期系统的康复治疗有利于膝关节功能恢复和减少术后并发症。因恶性骨肿瘤保肢手术创伤大,膝关节屈伸锻炼最早在手术1周后进行,而异体半关节移植的患者手术3周内需用支架固定。（2）术后感染、皮肤坏死、关节退变和不稳是导致肢体功能不良的主要因素。（3）异体半关节移植、保留自体髁部关节面的异体骨段移植、人工全膝关节置换的术后肢体功能优良率分别为48.6％、81.3％、90.9％。结论保肢手术方法选择应注重恢复肢体功能,术后早期进行康复训练有利于膝关节功能康复。     

U6启动子引导双链RNA特异性抑制骨保护素配体的表达

目的：构建能生成与骨保护素配体(osteoprotegerin ligand，OPGL)同源的发卡结构小双链RNA的载体并验证其对OPGLmRNA的抑制效应。方法：根据大鼠的OPGL的基因序列，参考OPGLmRNA的空间结构，设计发卡结构小干预RNA(short-interfering RNA，siRNA)模版，并构建由U6启动子引导产生siRNA的质粒载体。转染大鼠骨髓基质细胞，48h后提取细胞总RNA，Northern blot，以OPGL与内参β-actin自显影产物的灰度比值来反映OPGLmRNA的表达情况，结果进行统计学分析。结果：成功获得U6启动子引导产生siRNA的质粒载体，转染骨髓基质细胞后细胞中OPGLmRNA的表达量随着质粒载体量的增加而减少。结论：U6启动子引导产生siRNA的质粒载体能有效的减低OPGLmR-NA的表达量从而抑制OPGL的表达。     

使用人骨钙素启动子实现在体研究成骨细胞特定基因的功能

目的:使用骨钙素启动子构建骨组织特异性小发卡状RNA表达载体。方法:实验于2003-11/2004-09在解放军第四军医大学全军骨科研究所和全军整形外科中心完成。以HEK293细胞基因组为模板,利用聚合酶链反应扩增人骨钙素启动子。将骨钙素启动子、针对虫荧光素酶的小发卡状RNA编码序列和多腺苷酸信号依次克隆至pGL3-control载体的相应酶切位点,经双酶切鉴定和DNA测序证实后命名为pGL3-OCP-shLuc。将pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control分别共转染人胚胎肾细胞HEK293和人骨肉瘤细胞MG-63,48h后测定虫荧光素酶活性,计算相对活性。结果:使用特异性引物成功扩增出长度为830bp的人骨钙素启动子聚合酶链反应产物。DNA测序结果证实pGL3-OCP-shLuc中的小发卡状RNA表达框与设计完全一致。pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control共转染HEK293细胞后,虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异,而共转染MG-63细胞后虫荧光素酶相对活性显著降低,剔出效率约为69.8%。结论:成功使用人骨钙素启动子构建了小发卡状RNA表达载体,并实现了骨组织特异性RNA干扰,为将RNA干扰技术引入骨肉瘤基因治疗领域奠定了基础。     

人重组骨形态发生蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子在诱导成骨中的调节作用及其机制

目的：采用原位杂交的方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA的变化及其变化规律，对骨组织中的碱性磷酸酶(ALP)活性进行测定，以分析人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在诱导成骨中的调节作用及其调节机制。方法：BALB／c小鼠110只采用掷硬币方法随机分为2组，每组55只，设立rhBMP-2／bFGF为实验组，rhBMP-2为对照组，分别于术后3～21d共8个时间点取材，采用原位杂交方法对新生骨组织中的Ⅰ，Ⅱ型胶原mRNA进行检测；对ALP活性进行定量分析，观察2组在诱导成骨中Ⅰ，Ⅱ型胶原mRNA及ALP的表达情况。结果：①Ⅱ-型胶原mRNA的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随的。②作为成骨细胞成熟标志物的Ⅰ型胶原mRNA、ALP在软骨形成期即有表达，但是随着成骨细胞的出现，骨组织的形成Ⅰ型胶原mRNA仍表现为高表达，而ALP的表达则呈下降趋势。③实验组Ⅰ，Ⅱ型胶原mRNA及ALP的表达早于对照组，在术后7，14，21d，实验组ALP分别为(63.85&;#177;6.87)，(27．12&;#177;4．23)，(8.93&;#177;1，49)IU／g；对照组ALP分另U为(27．26&;#177;4．13)，(70.65&;#177;5.92)，(39.46&;#177;4.72)IU／g(t=12.40，20.85，17．52，P&;lt;0．01)。结论：bFGF增强了rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及ALP的表达。     

胶原-松质骨载体复合成骨细胞异体修复骨缺损的实验研究

目的探讨用胶原修饰松质骨载体表面后与成骨细胞复合进行异体移植的效果及其临床应用价值。方法新鲜牛松质骨经脱脂、H2O2浸渍及部分脱钙处理,制成去抗原块型牛松质骨载体(antigen-extractedmassivebovinecancellousbonecarrer,MBC)。载体表面经胶原处理后,与兔骨膜成骨细胞复合后体外共同培养,4周后将复合材料进行异体骨移植,并分别于2、4、8周和16周取材,行组织学HE染色观察。结果2周后,复合材料表面及孔内有了成骨组织细胞粘附生长,材料周围可见大量软骨细胞分化;4周时可见有新骨成熟成岛状分布;8周时观察到骨板形成;到16周时,骨缺损就已完全修复,MBC部分降解,但在新骨中仍能见到残留体。结论MBC载体表面经胶原处理后与成骨细胞的生物相容性更强,该材料复合后异体移植显示出了良好的骨诱导性和成骨活性及生物可降解性,有着广泛的临床应用价值。     

RNA干预法特异性抑制核激活因子受体配体诱导破骨细胞的形成

目的:使用RNA干预来特异性减少核激活因子受体配体的表达从而抑制破骨细胞的形成。方法:实验于2005-01/2006-10在解放军第四军医大学全军骨科研究所完成。①构建由U6启动子引导产生小干预RNA的质粒载体mU6pro-dsRANKL。②按0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0μg的梯度将质粒mU6pro-dsRANKL及对照质粒mU6pro转染大鼠骨髓基质细胞,48h后提取细胞总RNA。③采用Northern blot法检测,以核激活因子受体配体与内参β-肌动蛋白扩增产物的吸光度比值来反映核激活因子受体配体mRNA的表达情况。④再将质粒mU6pro-dsRANKL按0,1.0,2,3μg转染破骨细胞,抗酒石酸染色显微镜下观察。结果:①Northern blot结果:显示转染骨髓基质细胞后细胞中核激活因子受体配体mRNA的表达量随着质粒载体量的增加而减少。②破骨细胞抗酒石酸染色显示:破骨细胞的数量也随着质粒载体量的增加而减少。结论:U6启动子引导产生小干预RNA的质粒载体能有效的减低核激活因子受体配体的表达从而抑制破骨细胞的形成。     

个体化人工半膝关节假体计算机辅助设计和快速成型的基础:股骨髁三维建模

背景:目前保肢方法有异体骨关节置换、人工金属假体置换、肿瘤骨段灭活再植等,各有优缺点。四肢骨肿瘤切除深低温冷冻大段异体骨关节置换术存在异体-自体关节不匹配和后期关节软骨坏死影响关节功能的问题。目的:评估一种由螺旋CT扫描数据获取关节软骨表面轮廓信息的方法,为基于快速成型技术的个体化人工半膝关节研究奠定基础。设计:开放性实验。单位:解放军兰州军区乌鲁木齐总医院创伤一科。材料:实验于2001-09/2003-05在解放军第四军医大学西京医院骨科研究所和西安交通大学先进制造研究所完成。样本来源:CT扫描对象为25岁健康男性志愿者。方法:采用Picker6000螺旋CT对股骨远端进行层厚1mm扫描,在Picker6000CT机的VoxelQ图像工作站进行三维容积重建,之后对重建数据间隔0.1mm下载二维断层图像。自行开发数据格式转换软件,对下载图像进行滤波、去噪等处理,求出断面图像的二维边缘轮廓矢量化数据,输入美国Imageware公司Surfacer9.0软件进行矢量化三维重建。然后通过对关节软骨轮廓的识别及假体设计需要,提取出感兴趣的关节软骨表面轮廓的三维图像,用于个体化人工半膝关节的计算机辅助设计。主要观察指标:CT图像的矢量转换和股骨髁三维重建矢量图像。结果:利用自主开发的医学图像矢量转换软件,实现了CT图像数据的矢量转换,在Surfacer9.0三维处理软件中构建出个体化股骨髁三维实体模型,并根据设计需要进行编辑,提取出可进行人工半膝关节假体计算机辅助设计需要的关节软骨三维模型。所构关节面轮廓可进一步处理,从而完成人工半膝关节假体的计算机辅助设计;其文件格式为.stl格式,可直接被快速成形软件识别和用于工程学制造。结论:由螺旋CT数据进行关节软骨外形轮廓的矢量化重建可获得精确的关节软骨轮廓三维实体模型,模型可编辑性强,为复合大段异体骨移植的人工半膝关节假体的计算机辅助设计和快速成型制造打下了基础;用此方法进行医学图像信息的矢量转换简单易行,在骨科、口腔颌面外科生物制造领域有良好的应用前景。     

组织工程骨BCBB/BMP/bFGF的成血管作用观察

目的 观察吸附有骨形态发生蛋白(BMP)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的双相陶瓷生物骨(BCBB)植入兔股部肌袋内的成血管过程,评价bFGF的再血管化作用.方法 成年新西兰大白兔60只,随机分为4组,每组15只.A组:股部肌袋内植入BCBB/BMP/bFGF;B组:植入BCBB/bFGF;C组:植入BCBB/BMP;D组:植入BCBB.分别于术后4、8和12周取材,每个时间点每组取材5例标本,进行组织学大体观察、组织切片免疫组化血管染色并进行血管计数和血管面积图像分析.结果 组织学大体观察,术后各时间点A组所取标本较B组、C组和D组色泽红润,与周围组织连接紧密.血管计数和血管面积,术后各时间点A组血管数和血管面积均大于B组、C组和D组,B组大于C组和D组,且差异有显著性(P<0.05).结论 BCBB是生长因子的良好吸附栽体,适宜新生血管长入.吸附有bFGF及BMP的BCBB具有较强的再血管化能力,BMP能够促进bFGF的再血管化作用.     

BCBB/BMP/bFGF复合物修复股骨头坏死模型的成骨观察

目的 观察双相陶瓷生物骨(BCBB)、骨形态发生蛋白(BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fi-broblast growth factor,bFGF)复合物修复股骨头坏死(FHN)模型病灶清除区缺损,评价该复合物修复FHN的成骨作用.方法 取32只新西兰成年大白兔共64侧股骨头,微波灭活建立股骨头坏死模型,随机分为A、B、C、D 4组,每组16侧.A组为空白对照,B组植入BCBB/BMP,C组植入BCBB/BMP/bFGF,D组植入自体松质骨.术后2、4、8和12周分批处死动物,每组每次处死4只.行股骨头大体及解剖观察、X线摄片、组织学观察、钙含量及钙磷比检测.结果 ①股骨头大体及解剖观察:A组8周和12周各有1侧股骨头塌陷;B组12周时植骨区与宿主骨界限依然存在;C组及D组12周时植骨区与宿主骨界限不清.②X线摄片:A组12周时缺损仍然存在,有1侧股骨头塌陷;B组12周时骨移植区与宿主骨界限仍然存在;C组2周时骨移植区呈高密度影,与宿主骨界限清晰可见,8周时骨移植区密度低于宿主骨,与宿主骨界限模糊;D组12周时骨移植区密度与宿主骨相当,与宿主骨界限不清.③组织学新骨形成面积比较:8、12周时C组优于B组,且差异有显著性(P<0.05),C组、D组间差异无显著性(P>0.05).④X射线能谱分析:2、4和8周时B组、C组钙含量及钙磷比大于D组,与D组间比较差异具有显著性(P<0.05).结论 BCBB是生长因子的良好吸附载体,适宜新骨长入.BCBB/BMP/bFGF复合物具有较强的成骨能力.假如其安全性得到进一步证实,则有望为临床上FHN治疗提供一种有效的途径.