玻璃化保存工程化组织产品的实验与技术

目的:总结近年来玻璃化保存技术的新进展和多种工程化组织玻璃化保存的实验研究。探讨影响工程化组织低温保存的主要因素、评价指标等,以期指导玻璃化保存工程化组织的实验研究。资料来源:应用计算机检索Medline,EBSCO,ScienceDirect Onsite以及google scholar引擎中1980-02/2006-05关于细胞和组织低温保存的文献,检索词“tissue engineering,engineered tissue,cryopreservation,vitrification,ice-free cryopreservation,vitreous cryopreservation”,检索词被分别组合进行检索,限定文献语言种类为English。同时计算机检索万方数据库1980-02/2006-05关于细胞和组织低温保存的文献,检索词“组织工程,工程化组织,冻存,玻璃化保存”,限定文献语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选出与研究关系密切的文献。纳入标准:研究对象为动物或人,包括基础与临床研究内容。重点选取与玻璃化保存技术基本原理相关以及具体的工程化构建物玻璃化保存相关的文献。排除标准:关于配子,胚胎和植物,食品等的玻璃化保存文章。资料提炼:共检索到122篇关于细胞和组织低温保存的文献,其中与本实验关系密切的文献17篇,间接相关的文献42篇,最终纳入31篇符合标准的文献。资料综合:组织工程产业化要求长期而稳定的保存包含活细胞的工程化组织产品,以及产品中细胞与材料的黏附。相对于传统的低温冻存技术而言,玻璃化保存因在保存过程中无细胞内外冰晶形成,可以改善复温后的细胞活力,并能保护细胞和支架材料之间的黏附。本文从近年来玻璃化保存技术的新进展和多种工程化组织玻璃化保存的实验研究进行综述,分析了玻璃化保存液要求高浓度,对细胞有非特异毒性损伤,对悬浮单细胞的玻璃化保存能得到较高的细胞存活,而与支架材料结合的种子细胞存活除受到冻存试剂和流程的影响外还受到自身结构的影响。结论:玻璃化保存是较好的生物系统保存方法,可以为工程化组织产品提供可靠的保存,但急需发现新的低毒高效的玻璃化试剂以及优化保存流程。     

以部分脱钙冻干骨材料为支架组织工程骨移植早期免外周血T淋巴细胞亚群的变化

背景：骨衍生材料中冻干骨异抗原去除不充分，免疫原性强烈：脱蛋白骨和完全脱钙骨基质抗原性较弱，但前者无成骨诱导能力，后者生物力学性能很差，临床应用受到限制。目的：观察以部分脱钙冻干骨材料为支架的组织工程骨移植后兔外周血T细胞亚群的变化及移植组织的组织学变化。设计、时间及地点：随机分组设计、动物对照观察，于2006—06／2007—06在四川大学华西医院，生物治疗国家重点实验室与干细胞与组织工程研究室完成。材料：组织工程骨以兔骨膜来源的成骨细胞为种子细胞，经抗原自消化、部分脱钙、冻干后的异体骨为支架材料于体外构建。方法：将48只兔按随机数字表法分为4组，每组12只。分别用部分脱钙冻干骨、组织工程骨、自体骨、同种异体骨植入兔桡骨1cm节段性缺损处。主要观察指标：流式细胞仪检测4组植入前及植入后1，2，4周移植早期外周血T淋巴细胞亚群变化，并通过组织学检测观察植入后2，4，8，12周时4种材料的成骨作用。结果：①部分脱钙冻干骨组、组织工程骨组植入后1，2周外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞较植入前明显升高（P〈0．05）。植入后4周CD4^＋T细胞较植入前偏高不显著（P〉0．05）。自体骨组植入后CD4^＋和CD8^＋T细胞升高不明显（P〉0．05）。同种异体骨组植入后1，2，4周外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞较植入前及其他各组同期均明显增高（P〈0．05）。②组织工程骨组植入后2周与材料孔隙内有成骨细胞和成软骨细胞，可见骨及软骨混合性新生物形成，周边分布有破骨细胞，部分网架呈蚕食状被破坏吸收。植入后4周，形成的新生骨过渡为编织骨。植入后8周，形成板层骨，部分脱钙冻干骨支架材料已被完全降解、吸收。植入后12周，植入物均已完全被板层样骨所替代，髓腔再通。结论：部分脱钙冻干骨为支架材料构建的细胞-材料复合体移植后外周血T淋巴细胞增高，但不影响其良好的修复骨缺损能力。     

不同灭菌法对组织工程支架降解性和力学特性的影响

目的　研究不同灭菌方法对组织工程聚合物支架的灭菌效果以及灭菌处理对聚合物支架降解性和力学特性的影响。方法　选择聚合物支架PGA编织网和PLGA纤维 ,经环氧乙烷、紫外线、75 %酒精浸泡和γ射线照射 4种方法灭菌后 ,用细菌培养检测灭菌效果 ;用粘度法测定聚合物粘度 ,以观察聚合物的降解性 ;用拉伸实验测定聚合物支架的力学特性。结果　经 4种方法灭菌后 ,聚合物支架PGA编织网细菌检测均为阴性 ,都可达到灭菌目的。辐射剂量为 15kGy的γ射线照射和紫外线照射灭菌都可导致PLGA粘度下降 ,且均具有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,即这两种灭菌方法使PLGA的降解明显 ;相反 ,75 %酒精和环氧乙烷灭菌对PL GA粘度下降的影响没有显著性意义 (P >0 .0 5 ) ,即降解不明显。各种灭菌方法处理后支架的断裂伸长率差异无显著性意义 (P >0 .0 5 ) ;经 15kGy的γ射线照射和紫外线灭菌后 ,支架的最大载荷、断裂能量及抗拉强度均降低 ,差异具有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;经环氧乙烷和酒精浸泡灭菌方法处理的支架其最大载荷、断裂能量、抗拉强度均无明显改变 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论　环氧乙烷和酒精浸泡灭菌对支架降解性和力学特性影响均较小 ,是可降解聚合物支架较理想的灭菌方法。     

可塑形组织工程骨修复兔颅骨缺损的组织学及力学研究

目的探讨用藻酸钙凝胶、成骨细胞和骨粉复合构建可塑形组织工程骨修复兔颅骨缺损后,体内成骨的组织学及生物力学特征。方法28只日本大耳白兔,随机分为A组(16只)、B组(8只)和C组(4只)。制备兔颅骨左右两侧直径1cm的骨膜-颅骨全层缺损,左侧用藻酸钙凝胶-成骨细胞-骨粉填补修复为A1组(n=16);右侧用藻酸钙凝胶-骨粉填补修复为A2组(n=16);B组骨缺损不作处理,为空白对照组(n=16);C组为正常组。术后6周和12周时,行大体观察及组织学观察;12周时行生物力学测试。结果术后6、12周时,A1组:颅骨缺损基本被硬组织所修复,镜下见材料已大部分被骨组织替代,成骨面积为40.92%±19.36%;A2组:材料部分被骨组织替代,成骨面积为18.51%±6.01%;B组:颅骨缺损边缘可见硬组织形成,镜下见修复组织以致密纤维组织为主,成骨面积为12.72%±9.46%。术后12周,生物力学测试修复组织能耐受的最大压力载荷,A1组37.33±2.95N;A2组30.59±4.65N;B组29.5±2.05N;C组41.55±2.52N;A1组明显大于A2组和B组(P<0.05)。最大载荷时应变位移,A1组1.05±0.20mm;A2组1.35±0.44mm;B组1.57±0.31mm;C组0.95±0.17mm;A1组小于B组(P<0.05)。载荷/应变比值,A1组35.82±6.48N/mm;A2组24.95±12.40N/mm;B组19.90±5.47N/mm;C组47.57±11.22N/mm;A1组大于B组(P<     

体外构建与体内构建组织工程的比较研究

目的比较骨髓基质干细胞(MSCs)与生物衍生骨体内、体外复合构建的组织工程骨修复山羊胫骨大段缺损能力,以探讨修复缺损最佳途径。方法制备山羊胫骨中段20mm的骨骨膜缺损,分别植入体内、体外构建的组织工程骨、自体骨及单纯生物衍生骨,分别行组织学、X线观察、骨密度测定和生物力学测试。结果体外构建组材料降解较快,成骨迅速,16周时已可见髓腔再通;体内构建组以上各变化较前者慢2～4周;而单纯生物衍生骨对照组材料降解、新骨形成均较慢;6周时,各组弯曲应力值差异无显著性(P>0.05),12、16周时体外构建组高于体内构建组(P<0.05),体内构建组高于单纯生物衍生骨对照组(P<0.05)。结论体内、体外构建的组织工程骨成骨迅速、量大,排斥反应小;但是体内构建方式成骨较体外构建慢。     

组织工程化人工骨血管化研究

目的 比较三种促进组织工程化人工骨体内血管化方法的效果及研究血管化与成骨的相关关系。方法 将HA/β-TCP与PDLLA形成复合支架材料，再复合Ⅰ型胶原、rhBMP-2，与成骨细胞联合培养，仿生制备成组织工程化人工骨，采用包裹带血管蒂筋膜，复合血管内皮细胞或两者联合的促血管化手段。将人工骨修复兔桡骨干骨膜-骨完全缺损，手术后4、8、12周，观察移植物组织学，体视学方法观察血管化，成骨作用及其两者的关系。结果 3种方法均有促血管作用。其优劣依次为；材料包裹带血管蒂筋膜及复合血管内皮细胞大于材料单纯复合血管内皮细胞，后者又大于材料单纯包裹带血管蒂筋膜，术后4周为快速血管化阶段。4-8周间血管化有平缓发展，12周完全血管化，血管化与新骨生成数量成正相关。结论 促血管化手术对组织工程化人工骨移植修复骨缺损的效果起重要促进作用。     

表面改性及微沟槽技术对肌腱细胞生长与取向的影响

利用光刻技术制作微格式模板,微接触转印法制作微沟槽PDMS表面,微流道技术裱衬不同浓度的Ⅰ型胶原于微沟槽表面上,比较其对细胞生长形态及生长取向的影响.对照组为未裱衬胶原的微沟槽、平板PDMS及裱衬胶原的平板PDMS.种植SD大鼠肌腱细胞在材料上,于37℃孵箱中培养48 h.采用MTT比色法测定不同浓度的胶原对肌腱细胞的生长增殖的影响.通过倒置相差显微镜、扫描电镜、荧光显微镜观察细胞生长的形态,取向情况.结果显示:Ⅰ型胶原修饰的PDMS微沟槽材料比未裱衬胶原的对照组具有明显的促细胞生长的作用(P＜0.05),并且随着胶原浓度的增加作用越明显.有微沟槽表面的材料对细胞的生长形态和生长取向有明显影响.提示,Ⅰ型胶原修饰的微沟槽材料不仅能规范肌腱细胞的生长取向,而且能促进肌腱细胞的生长,从而得到理想的细胞生长形态,该结果对工程化肌腱的构建有重要的指导意义.     

工程化组织动物体内植入的生物力学测试

工程化组织逐渐成为修复病损组织最具挑战性的新型替代材料。这种材料具有生命活性，植人体内后被降解吸收的同时，可再生组织，从而修复组织缺损，达到牢固的自体组织愈合并重建功能。在研究工程化组织植入体内愈合的过程中，检测植入的工程化组织的生物力学特性是考察其愈合和修复效果的重要方面。本文介绍了工程化组织植人动物体内生物力学检测的样本制备及保存、基本试验方法、近似试验方法和有关对实验结果的影响因素，为工程化组织的体内检测提供重要参考。     

皮下浅刺法止痛效果观察

皮下浅刺法止痛效果观察秦廷武（邯郸市陶瓷公司医院０５６２００）杨向红（邯郸市中医院内三科０５６００１）在《灵枢·官针篇》中毛刺、扬刺、半刺等针法的启发下，运用皮下浅刺法治疗各种原因引起的疼痛，如内脏绞痛、局部肌痛、神经性头痛等取得了良好疗效。现将此法...     

纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨水泥增强骨质疏松松质骨性能的生物力学分析

目的:评价新型注射型纳米羟基磷灰石/酰胺66复合骨水泥体外增强聚骨质疏松性松质骨的生物力学性能,从而选择适合临床使用的骨水泥。方法:实验于2001-01/2003-01在重庆医科大学、四川大学纳米生物材料研究中心和四川大学生物治疗国家重点实验室完成。选取5具老年和1具青年的T1-T6脊柱和双侧股骨髁标本,经X线摄片未见明显病理性缺损和破坏。椎体压缩实验:将脊柱标本去除椎间盘和椎体后方成分后仅保留椎体34个。①老年椎体28个,随机分为4组:纳米羟基磷灰石/酰胺66含量60%的复合骨水泥组(HP1组)、纳米羟基磷灰石/聚聚聚酰胺酰胺66含量70%的复合骨水泥组(HP2组)、纳米羟基磷灰石/66含量80%的复合骨水泥组(HP3组)、骨质疏松组,7个标本/;青年组椎体6个,作为正常对照组。②HP1,HP2,HP3组分别注射含量为60%,70%和80%的纳米羟基磷灰石/酰胺66复合骨水泥5mL,骨质疏松聚组和正常对照组仅作穿刺。③测定每个标本的载荷-位移数据和压力-位移曲线,采样频率为10Hz。股骨髁松质骨扭转实验:用于实验的股骨髁10个。①老年股骨髁8个,随机分为4组:HP1,HP2HP3组及骨质,疏松组,2个/;青年股骨髁2个,作为正常对照组。②HP1,HP2,HP3组组分别注射含量为60%,70%和80%的纳米羟基磷灰石/酰胺66复聚合骨水泥20mL,骨质疏松组和正常对照组仅作穿刺。然后将各组股骨髁的松质骨制成10mm×10mm×30mm的松质骨条标本,5个/每组。测定各组的抗扭强度和抗扭刚度。结果:椎体压缩实验中保留34个椎体,股骨髁松质骨扭转实验中选用10个股骨髁,全部进入结果分析。椎体压缩实验:①各组屈服强度和最大抗压强度的测定:与骨质疏松组比较,HP1,HP2,HP3组均明显提高,HP1,HP2组尤为显著(P均<0.05);但HP1,HP2,HP3组仍均显著低于正常对照组(P<0.05)。②各组抗压刚度的测定:与骨质疏松组比较,HP1,HP2,HP3组均明显提高,HP1,HP2组尤为显著(P<0.05);但HP1,HP2,HP3组仍均低于正常对照组,且HP3组差异显著(P<0.05)。股骨髁松质骨扭转实验:①各组抗扭强度的测定:与骨质疏松组比较,HP1,HP2,HP3组的抗扭强度均明显提高,HP1,HP2组尤为显著(P<0.05);但HP1,HP2,HP3组的抗扭强度仍均低于正常对照组,HP2,HP3组尤为显著(P<0.05)。②各组抗扭刚度的测定:与骨质疏松组比较,HP1,HP2,HP3组的抗扭刚度均明显提高,HP1,HP2组尤为显著(P<0.05);但HP1,HP2,HP3组的抗扭刚度仍均低于正常对照组,HP3组尤为显著(P<0.05)。结论:注射型纳米羟基磷灰石与聚酰胺66复合骨水泥材料能够增强骨质疏松松质骨的抗压和抗扭性能,治疗骨质疏松骨折,预防椎体骨折的发生。另外,纳米羟基磷灰石/酰胺66含量为60%和70%的复合骨水聚泥有较好的抗压和抗扭性能,更符合临床应用的需求。