Real-time PCR法检测肾移植患者外周血淋巴细胞次黄嘌呤核苷酸脱氢酶基因表达

 目的建立测定肾移植术后患者外周血淋巴细胞中次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)Ⅰ型和Ⅱ型基因表达水平的Real-time PCR方法,研究吗替麦考酚酯(MMF)药效个体差异。方法取肾移植后门诊复查患者外周血分离淋巴细胞,提取总RNA,进行Real-time PCR反应,选用β-actin作为内参,靶基因的相对定量按公式得出:靶基因=2^-(△△Ct),高效液相色谱法测定吗替麦考酚酸(MPA)浓度。结果IMPDH表达个体间差异大(Ⅰ型0.118～3.313;Ⅱ型0.185～2.928),MPA对于个体IMPDH两种亚型的抑制程度不同,MPA的谷浓度>1.0mg·L^-1时,IMPDHⅠ型和Ⅱ型的基因表达水平表现出明显的抑制作用。结论本法实用性强,结果可靠、重现性好,可用于肾移植患者服用MMF后的药效个体化研究。     

迷迭香酸对高尿酸血症的影响

目的:研究迷迭香酸对次黄嘌呤为模型高尿酸血症小鼠的影响。方法:选用尿酸生成的前体物质次黄嘌呤(Hypoxanthine),i.p小鼠造成高尿酸血症动物模型,首先探讨造模剂的时效关系。应用低、中、高三个剂量(50,100,200mg·kg-1·d-1)迷迭香酸,i.g给药,连续3d。采用生化全自动分析仪测定小鼠血清尿酸水平。结果:选择次黄嘌呤i.p后45min血清尿酸水平的峰值造模,迷迭香酸(100,200mg·kg-1·d-1)均能显著减少小鼠高尿酸血症的血清尿酸水平,并有一定的量效关系,对正常小鼠的血清尿酸水平同样也有显著影响。结论:迷迭香酸对正常和高尿酸血症小鼠均具有降低血清尿酸水平的作用。     

日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达

目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因。方法依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物，上游和下游引物分别引入BamH I和Sal I酶切位点。以日本血吸虫大陆株（安徽株，简称Sjc-A）成虫总RNA为模板，反转录PCR (RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因。经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT，转化感受态E．coli BL21，并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcHGPRT/E．coli BL21I程菌用IPTG诱导表达，重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析。结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp，构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段，根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株（湖南株，简称Sjc-H）及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性。获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析，分子量约30 kDa，并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别。结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功，并获得了纯化重组蛋白，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础。     

恩再适注射液中咪唑丙烯酸、尿嘧啶、次黄嘌呤及黄嘌呤的含量测定

目的:建立同时测定恩再适注射液中4个主要成分咪唑丙烯酸、尿嘧啶、次黄嘌呤及黄嘌呤的高效液相色谱方法。方法:色谱柱为 Inertsil ODS 3柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.3%醋酸水溶液(1:99),流速:0.8 mL·min~(-1),柱温:25℃,检测波长:254 nm。结果:咪唑丙烯酸的线性范围为1.00～25.00μg·mL~(-1),平均回收率为101.5%;尿嘧啶的线性范围为0.995～19.50μg·mL~(-1),平均回收率为93.1%;次黄嘌呤的线性范围为0.20～5.00μg·mL~(-1),平均回收率为92.2%;黄嘌呤的线性范围为2.03～48.72μg·mL~(-1),平均回收率为97.0%。结论:本方法简便,准确,实现了多组分的快速同时测定,为制定恩再适注射液的质量标准提供了参考依据。     

HPLC法测定商品蛤蚧中核苷类成分的含量

目的建立HPLC法测定蛤蚧药材中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤的含量.方法采用高效液相色谱法.色谱条件为Doamonsil C18柱(5 μm,200 mm×4.6 mm),以0.05 mol/L磷酸氢二铵水溶液(pH=8.4)为流动相;检测波长为254 nm;流速1 ml/min.结果尿嘧啶、黄嘌啶、次黄嘌呤分别在0.06～0.14 μg、0.17～0.50 μg、0.27～0.6 μg范围内具有良好线性关系(r分别为0.9996、0.9998、0.9996);平均加样回收率分别为102.3%、100.6%、100.7%;RSD分别为1.84%、1.72%、1.65%.结论该法可用于测定蛤蚧药材中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤的含量,从而便于控制蛤蚧药材的质量.     

注射用疏血通的质量标准研究

目的制订注射用疏血通的质量标准。方法采用薄层色谱法鉴别水蛭;高效液相色谱法测定样品中次黄嘌呤的含量。结果次黄嘌呤在0.25~2.5μg呈良好的线性关系,r=0.999 7,加样回收率为98.4%,RSD=1.26%。结论该方法简便、准确、可以作为该制剂的质量控制标准。     

HPLC法测定海马中次黄嘌呤、黄嘌呤的含量

目的:建立海马中次黄嘌呤、黄嘌呤含量测定的方法。方法:采用Kromasil C_(18)柱(250mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-水(2:98,V/V)为流动相,测定波长λ=254nm。结果:次黄嘌呤在29.0～464.0 ng范围内呈良好的线性关系(r=0.99996);黄嘌呤在24.5～392.0 ng范围内呈良好的线性关系(r=0.9995)。平均加样回收率:次黄嘌呤为100.37％,BSD为1.31％;黄嘌呤为100.54％,RSD为1.14％。结论:本法操作简便,结果可靠,为海马药材的质量控制提供了有效的方法。     

尿囊毒酸对大鼠血清尿酸水平的影响

目的 观察次黄嘌呤、尿酸酶抑制剂尿囊毒酸对大鼠血清尿酸水平的影响,拟建立一种新型实验性大鼠痛风病理模型.方法 采取合用次黄嘌呤和尿囊毒酸为造模药物,制备大鼠高尿酸血症动物模型,比较单用次黄嘌呤及合用尿囊毒酸对受试动物血清尿酸水平的影响,并对造模药物的量效、时效关系等因素进行了考察.结果 次黄嘌呤与尿囊毒酸合用并以适当的剂量和给药方式,可使受试动物血清尿酸稳定持续增高(≥1 000 μmol/L),造成实验性高尿酸血症动物模型.结论 实验证明单用次黄嘌呤不能升高大鼠的血尿酸水平,必须配合尿酸酶抑制剂尿囊毒酸,方可升高大鼠尿酸水平(P＜0.01).采用连续给药方式,动物血清尿酸水平可大幅持续升高.     

中药有效成分对肿瘤恶病质脂耗竭的抑制作用

为探索抑制毒激素-L所诱导的恶病质脂耗竭的有效药物,将中药有效成分次黄嘌吟、尿囊素、腺嘌吟、大叶茜草素及欧琴素—乙等分别与毒激素-L和从大鼠获得的脂细胞一起孵育,并与单纯中药组和单纯毒激素-L组相比较。结果5种中药成分和毒激素-L组的游离脂肪酸的含量明显低于单纯毒激素-L组(P<0.01),提示5种中药成分均可抑制毒激素-L所诱导的脂解反应。而单纯中药组与正常对照组无差异(P>0.05),提示该5种中药成分对正常脂解反应无影响。     

5种水蛭中尿嘧啶,黄嘌呤,次黄嘌呤的含量比较

采用反相HPLC法测定了宽体金线蛭、光润金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭及不同产地的宽体金线蛭中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤的含量。色谱柱为Shim-pack CLC-ODS C_(18)柱,流动相:0.05mol/l的磷酸氢二铵溶液(pH=8.4),流速:0.8ml/min,检测波长:254nm,回收率:>98.0％。本法准确、快速、重现性好。