流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒（H5N1）的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

2015 - 2016年江苏省0～15岁健康儿童肠道病毒携带情况调查

目的 了解江苏省2015 - 2016年15岁以下健康儿童肠道病毒（enterovirus,EV）的携带情况及病毒型别的特征分布。方法 采集江苏省3个县（市）15岁以下健康儿童粪便标本445份,进行病毒分离和鉴定。脊灰病毒（PV）采用荧光定量RT - PCR方法进行鉴定;非脊灰肠道病毒（NPEV）采用RT - PCR扩增结合VP1区基因测序定型。结果 共检测到EV31株,阳性率6.97％（31/445）。其中PV18株,阳性率4.04％（18/445）,包含Ⅰ型8株、Ⅱ型7株、Ⅲ型3株,未分离到混合型PV。所有的PV毒株经鉴定均为疫苗株,无脊灰野病毒株与疫苗衍生株。NPEV13株,阳性率2.92％（13/445）,以HEV - B群（84.62％(11/13)）为主。所有NPEV分离株与对应标准株的核苷酸序列同源性在92.01％～97.42％之间,氨基酸序列同源性在92.91％～99.19％之间。构建进化树进行同源性分析发现,所有的NPEV分离株与对应的标准株聚集在一起,符合测序定型标准。结论 在2015 - 2016年度江苏省健康儿童中,PV阳性率与急性迟缓性麻痹（AFP）监测相当,但NPEV阳性率远低于AFP监测。检测到的NPEV以HEV - B群为主,未检测到脊灰野病毒,江苏省继续保持无脊灰状态。     

江苏省2018年健康人群破伤风IgG抗体水平调查北大核心

目的了解江苏省2018年健康人群破伤风IgG抗体水平。方法采用分层抽样选择江苏省3个区县9个年龄组健康人群,采用酶联免疫吸附试验检测血清破伤风IgG抗体,分析抗体阳性率和几何平均浓度(GMC)。结果江苏省2018年健康人群破伤风IgG抗体总阳性率为68.67%(618/900),抗体GMC为0.071IU/mL。年龄别抗体阳性率在7.00%(30-39岁)-100%(0-2岁)之间(χ^2=610.26,P<0.001);0-14岁、≥30岁人群抗体阳性率分别为97.40%(487/500)、8.50%(17/200)。结论江苏省健康人群破伤风抗体水平随着年龄的增长而降低;建议开展成人尤其是育龄期妇女破伤风疫苗补充免疫。     

含肠道病毒71型VP1基因片段RNA病毒样颗粒的构建

[目的]构建含肠道病毒71型(EV71)VP1基因片段的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒。[方法]利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2。将EV71VP1基因片段连接到中间载体噬菌体基因的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV71。将重组质粒pET32a-MS2-EV71转化宿主菌,经IPTG诱导表达获得病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行透射电镜观察、RT-PCR检测和稳定性试验。[结果]重组质粒pET32a-MS2-EV71经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功;透射电镜观察到直径大约23nm的圆形病毒样颗粒;RT-PCR和稳定性试验结果表明,诱导产生的病毒样颗粒含EV71VP1基因片段,并且稳定性良好。[结论]成功构建了含EV71VP1基因片段的病毒样颗粒,稳定性良好,可作为病毒检测时标准品和质控品使用。     

多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术检测呼吸道病原体

目的 建立一种呼吸道病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测方法.方法 针对几种重要的呼吸道病原体(甲型流感病毒、乙型流感病毒、SARS冠状病毒、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌以及腺病毒)保守区基因设计引物,进行多重PCR反应、核酸侵入反应及纳米金显色反应,对多种呼吸道病原体同时进行检测,以人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、肺炎链球菌4种呼吸道病原核酸评价其检测特异性,以体外转录的病毒RNA或扩增的PCR片段评价其检测敏感性.结果 成功建立了一种呼吸道病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测技术.建立的检测方法可特异的检测目的病原体,且与人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、肺炎链球菌无交叉反应.该方法对不同靶标的检测灵敏度介0.5 ～50拷贝/μL.结论 建立的呼吸道病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术的检测方法,具有较高的检测特异性及灵敏度,检测通量高,肉眼即可观察结果,在传染病病原体检测方面具有广阔的应用前景.     

Stxl-A亚单位的原核表达、复性及抗原性鉴定

目的 构建志贺毒素1-A亚单位(Stxl-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以大肠埃希菌0157 DNA为模板扩增Stxl-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a( ),转化大肠埃希菌B121(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶协鉴定和测序分析后证实构建成功.重组蛋白经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stxl-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带.结论 成功构建了pET32a( )/Stxl-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stxl-A蛋白,为进一步制备抗Stxl-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础.     

乙型肝炎表面抗原-破伤风类毒素结合疫苗的制备及免疫学特性

目的 制备乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)与破伤风类毒素(TT)结合疫苗,并研究其免疫学特性.方法 TT经溴化氢活化后与己二酰肼形成TT-酰肼基衍生物,在碳二亚胺作用下与HBsAg共价结合.将结合物、HBsAg及乙肝疫苗免疫小鼠,并设生理盐水对照组,分别于7、14、21、28 d取血,应用化学发光法检测小鼠血清抗-HBs,于第7、28天应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测脾单个核细胞(mouomlclear cells,MNC)分泌HBsAg特异性IFN-γ和IL-2能力.结果 成功制备了HBsAg-TT结合物,该结合物诱导抗-HBs阳转率及抗体滴度均较单独免疫HBsAg及乙肝疫苗组高,主要以IgG2a抗体为主,且分泌IFN-γ和IL-2的淋巴细胞数也显著增加.结论 用该方法 制备的HBsAg-TY结合疫苗,不仅可诱导较强的体液免疫,还可诱导以TH1应答为主的细胞免疫.