p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡信号通路在大鼠抗GBM肾炎中的作用

目的:探讨p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡信号通路在大鼠抗肾小球基底膜(GBM)肾炎中的作用。方法:1:复制大鼠抗GBM肾炎模型,于实验第2、7、14、21、28天取肾组织行免疫印迹法检测p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3的表达。2:应用p38MAPK阻断剂SB203580处理大鼠抗GBM肾炎模型,于实验第2、7、14天检测24小时尿蛋白、血肌酐及血尿素氮含量;第14天取肾组织,经光镜观察肾组织病理变化;TUNEL法检测肾组织细胞凋亡情况;免疫印迹和免疫组织化学法检测肾组织p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3表达情况。结果:在成功复制大鼠抗GBM肾炎模型基础上,免疫印迹结果显示肾炎模型组大鼠p-p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3蛋白表达各时间点均明显高于正常对照组,而p38MAPK表达与正常对照组相比无明显差异。在成功复制大鼠抗GBM肾炎模型基础上,阻断剂SB203580降低了大鼠抗GBM肾炎生化指标,减轻了肾炎病理反应,抑制了p-p38MAPK、FasL、Fas、Caspase-3的表达,降低了肾组织细胞凋亡数。结论:p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡信号通路在大鼠抗GBM肾炎发病机制中发挥重要作用,其阻断剂SB203580减轻了大鼠抗GBM肾炎的病理改变,为临床防治人类新月体性肾炎提供实验理论依据。     

乙型肝炎病毒X基因促TRAIL诱导Huh7细胞凋亡的机制

目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因(HBX)促肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL)蛋白诱导人肝癌细胞Huh7凋亡的机制。方法应用脂质体转染法将pcDNA3.1-HBX、pcDNA3.1分别转染Huh7细胞,建立稳定表达HBX的细胞模型Huh7-HBX和空载体对照细胞模型Huh7-3.1;运用TRAIL蛋白分别作用Huh7-HBX细胞、Huh7-3.1及Huh7细胞后,采用CCK8、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况;Western blot检测死亡受体4(deathreceptor 4,DR4)和死亡受体5(death receptor 5,DR5)的表达情况;分光光度法检测细胞caspase8和caspase3活性。结果 RT-PCR及Western blot证实成功构建细胞株Huh7-HBX;CCK8和流式细胞术检测结果均显示Huh7-HBX细胞的凋亡率明显高于Huh7-3.1及Huh7(P<0.05);Western blot显示Huh7-HBX细胞的DR4、DR5的表达量明显高于Huh7-3.1及Huh7细胞(P<0.05);caspase活性检测结果显示,Huh7-HBX细胞caspase8及caspase3的活性明显高于Huh7-3.1及Huh7(P<0.05)。结论 HBX能够通过上调Huh-7细胞表面死亡受体DR4、DR5的表达,进而促进TRAIL蛋白诱导的细胞凋亡,为进一步研究HBX的促凋亡机制提供实验依据。     

乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.     

以典型案例为引导的基础医学实验课程设计与探索

实验教学改革是高等医学教育改革的重要方面,如何在医学教育改革现阶段,配合整体改革趋势,逐步调整现有基础医学实验教学体系与模式,顺应理论教学改革步伐,是当前实验教学改革的课题之一.在病原生物学实验教学中,我们积极探索基于案例的临床思维及实验技术培养体系.依据临床典型案例为引导,引入实验课程基本内容;同时依据临床诊疗及相关科研进展,拓展课程学习要求.落实"早临床、多临床、反复临床"的医学教育构想,打造整合基础医学知识、融入思政内涵的医学实验课程"金课",提高课程高阶性、创新性及挑战度,促进学生职业素质及创新能力的全面提升.     

p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在缺血性脑损伤中的作用研究

目的探讨p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在大鼠缺血性脑损伤中的作用。方法①制作大鼠全脑缺血模型,免疫印迹法检测假手术组、脑缺血复灌6 h、12 h、1 d、3 d组p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表达。②免疫印迹法检测假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SB203580组p-p38MAPK、p38MAPK、FasL、Fas和Caspase-3蛋白表达。结果①与假手术组相比,脑缺血再灌注6 h、12 h、1 d、3 d组p-p38MAPK蛋白表达水平逐渐升高,于1 d达高峰(P均<0.05)。②与缺血复灌组和溶剂对照组相比,SB203580组p-p38MAPK、FasL和Caspase-3表达水平显著降低(P均<0.05)。结论 p38MAPK介导的Fas/FasL凋亡通路在缺血性脑损伤中发挥了重要作用。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体胞外区基因原核系统的表达与纯化

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员之一,能够诱导前列腺癌、膀胱癌、肺癌等多种肿瘤细胞凋亡,但不影响正常细胞[1-3].本研究旨在观察重组TRAIL融合蛋白(GST-rTRAIL)的表达,探讨其包涵体蛋白的复性和纯化方法.     

华支睾吸虫感染小鼠肝脏中TLR2 mRNA动态表达的初步研究

目的观察华支睾吸虫感染小鼠肝脏中TLR2 mRNA的动态表达。方法建立华支睾吸虫感染小鼠模型,在感染不同时间点(1、2、4、7、14、28、568、4 d)取肝脏,采用逆转录聚合酶链反应检测肝脏TLR2 mRNA的表达,同时行HE染色观察感染小鼠各时间点肝脏病理学变化。结果与未感染对照组相比,感染组自感染后第7 d起TLR2 mRNA表达升高(P<0.05),至第28 d达到高峰,之后开始下降,至第56 d仍高于未感染对照组(P<0.05),第84 d下降至未感染对照组相近水平。病理学观察发现,感染小鼠肝脏于第4 d始,汇管区轻度炎症反应;第7 d,炎症反应加重,或见嗜酸性脓肿;第14 d,嗜酸性脓肿增多,纤维组织增生,周围小胆管增生;第28 d,胆管壁增厚,周围炎性渗出明显;第56 d,胆管上皮不同程度增生,增生的上皮呈腺样结构;第84 d,胆管周围炎性细胞减少,纤维增多,管壁增厚。结论 TLR2 mRNA在华支睾吸虫感染过程中表达升高,推测TLR2可能参与调控华支睾吸虫感染引发的Th1/Th2免疫应答和病理改变。     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

炎症与趋化因子IL-6／MIP-2在癫痫小鼠海马的表达变化

目的观察炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和趋化因子巨噬细胞炎性蛋白-2（mac—rophage inflammatory protein-2,MIP-2）在海人藻酸（kainie acid,KA）致痫模型小鼠海马的表达变化。方法雄性C57／B6小鼠48只,随机分为生理盐水对照组和KA致痫组,KA致痫组再根据KA注射后3、6、12、24、72h各时间点分为5个亚组。观察KA注射后小鼠的痫性发作情况,并采用Real—timePCR检测在KA注射后不同时间点小鼠海马IL-6和MIP-2的mRNA丰度变化,运用免疫组化法观察IL-6和MIP-2在海马的蛋白表达改变。结果与对照组比较,致痫模型组小鼠海马IL-6和MIP-2的mRNA水平在KA刺激3h明显升高（P〈0．05）,24h达到高峰（P〈0．01）,72h开始降低;与对照组相比,KA刺激24h,海马CA3区IL-6和MIP-2的蛋白表达显著升高。结论癫痫小鼠海马炎症因子和趋化因子表达水平升高,引发中枢炎症反应,可能成为癫痫发病的重要机制之-。