高同型半胱氨酸血症对主动脉组织Bcl-2基因甲基化影响

目的:探讨高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症(Hhcy)对大鼠主动脉组织Bcl-2基因启动子区甲基化水平的影响。方法:健康6周龄雄性Wistar大鼠24只,体重(160±10)g,适应性喂养1周后随机分为对照组和Hhcy组,每组12只。对照组给予AIN-93G配方饲料,Hhcy组饲以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G配方饲料。喂养18周后,全自动生化仪测定血浆同型半胱氨酸浓度。HE染色观察大鼠主动脉组织形态学变化,免疫组织化学检测大鼠主动脉组织Bcl-2表达;巢式降落式PCR联合甲基化特异性PCR检测Bcl-2基因启动子区甲基化水平,荧光RT-PCR检测主动脉组织Bcl-2基因mRNA表达。结果:18周蛋氨酸饮食可以诱导大鼠Hhcy;HE染色主动脉组织呈现动脉粥样硬化早期形态学变化,免疫组织化学显示Hhcy组主动脉组织Bcl-2表达增加;Hhcy组主动脉组织Bcl-2基因启动子区甲基化水平低于对照组(P<0.05),Bcl-2基因mRNA表达高于对照组(P<0.05)。结论:Hhcy通过降低Bcl-2甲基化水平,使Bcl-2表达增加,平滑肌细胞凋亡减弱,可能是其参与动脉粥样硬化形成的分子机制之一。     

靶向HIF-2 siRNA对人胰腺癌BXPC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的观察靶向缺氧诱导因子2(HIF-2)的小干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌BXPC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法将BXPC-3细胞随机分为A、B、C组,A组转染HIF-2 siRNA、B组转染非特异性siRNA、C组不转染,分别予常氧、缺氧环境下培养;采用MTT法检测培养24、48、72、96 h时BXPC-3细胞的光密度(OD)值观察增殖情况,用流式细胞仪检测培养48 h时BXPC-3细胞凋亡率。结果在缺氧培养48 h时,A、B、C组细胞OD值分别为0.54±0.07、0.69±0.09、0.72±0.13,72 h时分别为0.55±0.11、0.88±0.07、0.88±0.05,96 h时分别为0.56±0.12、0.93±0.11、0.94±0.09;A组与B、C组比较,P均<0.05。在缺氧培养48 h时,A、B、C组细胞凋亡率分别为21.37%±0.17%、7.12%±0.03%、7.24%±0.07%;A组与B、C组比较,P均<0.05。在常氧状态下,各组细胞OD值及凋亡率无明显差别。结论缺氧状态下,靶向HIF-2 siRNA可抑制人胰腺癌BXPC-3细胞增殖,诱导其凋亡。     

下呼吸道感染患者铜绿假单胞菌分离株氨基糖苷类耐药相关基因分析

目的探讨分离自下呼吸道感染患者的氨基糖苷类耐药铜绿假单胞菌的耐药机制。方法从下呼吸道感染患者痰液中分离出52株对氨基糖苷类耐药的铜绿假单胞菌,PCR法检测6种氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因,并检测其中泛耐药菌的6种16S rRNA甲基化酶基因(以下简称甲基化酶基因)。对阳性产物测序加以证实。结果 52株铜绿假单胞菌中检出4种AMEs基因[aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb、aac(6’)-Ⅱ和ant(2″)-Ⅰ],AMEs基因总检出率为92.3%。泛耐药菌中检出1种甲基化酶基因(rmtB)。16株高水平泛耐药菌中rmtB基因的检出率为81.3%。结论分离自下呼吸道感染患者的氨基糖苷类耐药铜绿假单胞菌中AMEs基因携带率高,其对氨基糖苷类耐药与aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb、aac(6’)-Ⅱ和ant(2″)-Ⅰ有关;对氨基糖苷类高水平泛耐药主要与甲基化酶基因rmtB有关。     

La、hVAP-33、eIF2B γ和HCV IRES特异性小干扰RNA抑制HCV的复制和表达

目的 证实La自身抗原、33kD人类囊相关膜蛋白(hVAP-33)和真核细胞翻译起始因子第3亚单位(eIF2B γ)是HCV在细胞内的协同感染因子,通过抑制Huh7细胞内这些因子的表达可抑制HCV复制和表达. 方法 分别设计合成3条HCV内部核糖体进入位点(IRES)的小干扰RNA(siRNAs),转染Huh7-HCV细胞后筛选出其中沉默效率最高的1条.以HCV假病毒感染Huh7细胞后48 h,分别以上述HCV IRES siRNA和之前试验中已经筛选出的La、hVAP-33和eIF2B γ特异性siRNAs单独或者不同组合转染Huh7-HCV细胞,利用荧光定量PCR方法检测HCV核心基因并计算△△CT值(相对定量法),比较不同siRNAs及组合对目的基因沉默的效率;同时以Western blot观察HCV核心蛋白表达量的差异.结果 La自身抗原与IRES特异性siRNA共转染对HCV表达的抑制效率最高,使HCV核心蛋白基因相对表达量下降了约41％;4种基因特异性siRNAs 对HCV在Huh7细胞中的复制和表达均有不同程度的抑制作用,La、hVAP-33和eIF2Bγ特异性siRNAs分别与IRES siRNA联合均较其单独转染对目的基因的抑制效率高.结论 可以认为La自身抗原、hVAP-33和eIF2Bγ是HCV在宿主细胞内的协同感染因子,通过对Huh7细胞内协同感染因子及HCV IRES基因沉默后可以显著减少HCV的表达.     

siRNA沉默PKM2对胃癌BGC-823细胞增殖和迁移的抑制作用

在恶性肿瘤组织中,丙酮酸激酶（PK）的组织特异性同工酶（L型、R型、M1型PK）表达减少,而PKM2表达升高,在肿瘤细胞生长、增殖、迁移等方面发挥重要作用。目的：探讨siRNA沉默PKM2对胃癌BGC-823细胞增殖和迁移的抑制作用。方法：以蛋白质印迹法筛选出高表达PKM2的胃癌细胞株BGC-823。构建PKM2siRNA干扰质粒,稳定转染胃癌BGC-823细胞,同时以转染空质粒pU6作为阴性对照组。以荧光定量PCR和蛋白质印迹法在mRNA和蛋白质水平上验证干扰效果,以CCK8法和细胞迁移实验检测细胞增殖和迁移能力。结果：与阴性对照组相比,PKM2siRNA转染组PKM2mRNA和蛋白表达明显下降,细胞增殖能力和迁移能力明显下降（P〈0．05）。结论：PKM2在人胃癌的发展中发挥重要作用,并对胃癌BGC-823细胞增殖和迁移有一定的促进作用。     

糖代谢异常患者肾功能状态对冠脉病变程度的影响

目的探讨糖代谢异常人群中估算的肾小球滤过率（eGFR）对冠脉病变范围及严重程度的影响。方法采用简化的肾脏疾病饮食改良公式（MDRD）计算eGFR,比较不同MDRD-eGFR组在临床生化指标、狭窄冠状动脉支数、冠状动脉狭窄严重程度积分等方面的差别。结果糖调节受损组、糖尿病组及总体人群中,狭窄冠脉支数、Gensini积分与MDRD—eGFR均呈负相关性（P〈0．05）,与肌酐均呈正相关性（P〈0．05）。MDRD-eGFR〈60mL·mm-1·（1．73m2）-1 组狭窄冠脉支数多于60～89mL·min-1·（1．73m2）-1组及≥90mL·min。-1·（1．73m2）-1组,Gemini积分也高于其余两组（均P〈0．05）。校正年龄、空腹血糖、糖化血红蛋白、尿素氮、肌酐及尿酸因素后,狭窄冠脉支数、Gensini积分与MDRD—eGFR之间均呈负相关性,偏相关系数分别为-0．051和-0．022（P〈0．05）。Logistic逐步回归分析显示MDRD—eGFR为发生3支及以上冠脉病变的独立危险因素。结论糖代谢异常人群具有较高的冠心病患病率,肾小球滤过率的下降与冠脉病变程度具有一定的负相关性,且为发生多支冠脉病变（≥3支）的独立危险因素。     

Germline promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in gastric cancer

AIM: To explore germline hypermethylation of the tumor suppressor genes MLH1, CDH1 and P16^INK4a in suspected cases of hereditary gastric cancer (GC).METHODS: A group of 140 Chinese GC patients in whom the primary cancer had developed before the age of 60 or who had a familial history of cancer were screened for germline hypermethylation of the MLH1, CDH1 and P16^INK4a tumor suppressor genes. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and modified by sodium bisulfite. The treated DNA was then subjected to bisulfite DNA sequencing for a specific region of the MLH1 promoter. The methylation status of CDH1 or P16^INK4a was assayed using methylation-specific PCR. Clonal bisulfite allelic sequencing in positive samples was performed to obtain a comprehensive analysis of the CpG island methylation status of these promoter regions.RESULTS: Methylation of the MLH1 gene promoter was detected in the peripheral blood DNA of only 1/140 (0.7%) of the GC patient group. However, this methylation pattern was mosaic rather than the allelic pattern which has previously been reported for MLH1 in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) patients. We found that 10% of the MLH1 alleles in the peripheral blood DNA of this patient were methylated, consistent with 20% of cells having one methylated allele. No germline promoter methylation of the CDH1 or P16^INK4a genes was detected.CONCLUSION: Mosaic germline epimutation of the MLH1 gene is present in suspected hereditary GC patients in China but at a very low level. Germline epimutation of the CDH1 or P16^INK4a gene is not a frequent event.     

重组人纽兰格林对心力衰竭大鼠线粒体功能的影响

目的观察重组人纽兰格林(neuregulin,NRG)对心力衰竭(HF)大鼠线粒体功能的影响,并探讨其机制。方法雄性Wister大鼠40只,结扎大鼠左冠状动脉建立缺血性HF模型。4周后,建模成功的24只大鼠随机分为NRG组[NRG 10μg/(kg·d)],AG825组[AG825 50μg/(kg·d)]及HF组,各组8只,另6只大鼠作为假手术组(Sham组)。各组干预10 d,于实验结束时提取左心室梗死区外心肌线粒体,测定线粒体膜电位(MMP)、呼吸控制率(RCR)及组织ATP酶活性,同时测定活性氧水平及谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)mRNA水平。结果与Sham组比较,HF组大鼠线粒体功能受损,MMP下降、RCR及ATP酶活性降低,活性氧生成增加,GSHPX mRNA表达减少。与HF组比较,NRG组大鼠MMP增高,线粒体RCR改善,ATP酶活性增多,活性氧生成减少,GSHPXmRNA表达增加,而AG825组RCR、MMP和ATP酶活性均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论 NRG明显改善衰竭大鼠线粒体功能,NRG对衰竭心肌线粒体功能的保护作用,可能与其抗氧化应激作用有关。