具有靶向免疫抑制作用新型重组融合蛋白B7-2-PE40KDEL真核表达载体的构建及其生物效应

目的:构建B7-2-PE40KDEL的真核表达载体,探讨通过体内表达重组融合蛋白,特异性杀伤高表达CD28 T细胞,阻断B7∶CD28/CTLA4共刺激信号途径诱导免疫耐受的可能性.方法:以原核表达载体pRSETA-B7-2-PE40KDEL质粒为模板,采用PCR及酶切连接的方法构建真核表达载体pcDNA3.1/Zeo( )-B7-2-PE40KDEL.利用RT-PCR、Western 印迹及ELISA法从mRNA、蛋白质水平检测了B7-2-PE40KDEL在RPE-CHO真核细胞中的表达情况.采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28 T细胞的生物活性进行测定.结果:成功构建了pcDNA3.1/Zeo( )-B7-2-PE40KDEL真核表达载体,转染入RPE-CHO细胞后可转录翻译为重组融合毒素蛋白,相对分子质量约为71×103,平均106个转染细胞24 h表达0.23 μg/L.活性测定显示真核载体所表达的B7-2-PE40KDEL可特异性地抑制高表达CD28的人T淋巴细胞系,而对CD28阴性的人白血病细胞系的抑制率较低.结论:真核载体表达的B7-2-PE40KDEL具有良好的靶向性免疫抑制活性,为进一步开展其体内特异性防治移植排斥反应及自身免疫性疾病奠定了基础.     

凋亡素原核表达载体的构建和表达

目的 构建凋亡素原核表达系统，以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 通过PCR方法，以pcDNA-VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达栽体pET-DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后，聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38300的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达栽体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

hTERT-siRNA表达载体的构建及对MCF-7细胞生长、端粒酶活性的抑制作用

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径.方法 设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT,同时构建不针对任何基因的阴性对照重组pGenesiL-HK.两种重组质粒经酶切、电泳分析和测序鉴定后,用脂质体转染法分别转染乳腺癌MCF-7细胞,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功.转染pGenesil-hTERT的MCF-7细胞,凝胶电泳见端粒酶特征性条带明显减少,端粒酶活性受到明显抑制pGenesil-hTERT转染细胞后凋亡率较对照组明显升高(P＜0.01),且转染48h凋亡率最高,达54.7%±2.41%.结论 hTERT-siRNA可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性、促进细胞凋亡,此法有望应用于肿瘤基因治疗.     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

A study on improvement of expression of human G－CSF cDNA transferred with retroviral double－copy vector

ＡｓｔｕｄｙｏｎｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＧ－ＣＳＦｃＤＮＡｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｗｉｔｈｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｄｏｕｂｌｅ－ｃｏｐｙｖｅｃｔｏｒＧｕｏＢａｏｙｕ（郭葆玉）；ＺｈａｎｇＳｕｙｉｎｇ（张淑英）；ＸｕＨｕｉ...     

平板运动试验及心向量对冠心病诊断价值的评价

目的 探讨平板运动试验及心向量对冠心病的诊断价值。方法 典型心绞痛64例，不典型心绞痛44例进行平板试验及心向量检查。结果 108例受检，冠状动脉造影正常42例，冠状动脉狭窄≥50％66例。两种方法检出冠心病的敏感性分别为81．8％和56．0％。结论 平板运动试验诊断冠心病的敏感性高于心向量，特别是对于右冠及双束支病变的冠心病患。     

Assessment of vector microfilarial uptake as a comparatively non-invasive technique for monitoring onchocerciasis treatment campaigns in the Americas

Summary Since 1992, efforts have been made to combat onchocerciasis in Guatemala through mass distribution of ivermectin. The impact of the campaign is assessed by taking skin-snips from sentinel groups within selected communities. This method gives an estimate of the prevalence and intensity of infection, and thus the efficacy of the treatment. In some communities people are becoming reluctant to volunteer for skin-snipping, and so there is a need for an alternative technique that will give quantitative results. In most hyperendemic communities in Guatemala, biting blackflies are so ubiquitous that few people object to allowing 10 to 20 flies to engorge upon them. We examined data on the quantitative uptake of microfilariae by Simulium ochraceum before and after ivermectin distribution to see whether results similar to skin-snip data could be obtained. Counts of microfilariae ingested by S. ochraceum are compared to the numbers found in skin-snips from the same volunteers. In a group of 31 untreated infected persons, a skin-snip survey detected 64.5% positive, while feeding flies (vector microfilarial uptake, VmfU) detected 96.8%. Post-treatment, in a sample of 58 of whom 52 (89.7%) had a history of infection, both skin-snips and VmfU detected 54.2%. Vector blood meals contained more microfilariae than a mg of skin before treatment, but both recorded about equal numbers after treatment. When the data set was subdivided to compare samples taken at 2–3, 6–8 and 14–17 months post-treatment, the effect of ivermectin was still apparent at 6–8 months, but had virtually disappeared by 14 months post-treatment. A surprising observation was that the flies ingested fewer microfilariae from treated persons than was expected from the skin densities as estimated by skin-snip. This effect lasted for over 8 months, and could indicate that ivermectin has a greater effect on transmission than previously suspected. We conclude that VmfU could be used as an alternative to skin-snipping, and discuss the ethical implications.     

一种直接高效克隆PCR产物的载体制备

Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ经ＥｃｏＲ Ｖ酶切后，在Ｔａｑ酶作用下加入ｄＴＴＰ使其３’端加上碱基“Ｔ”而成为３’端突出的粘性末端载体。用此载体直接与ＰＣＲ产物连接进行克隆。克隆效率比采用平端载体克隆的效率提高约５０倍。     

T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究

将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3－T，并运用pcDNA3－T直接克隆了由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因。结果：pcDNA3－T与PCR产物的重组率高达70％。提示：该方法具有简便，省时等特点。     

基于支持向量机的脊柱离体组织电阻抗识别

目的 测量不同脊柱组织的电阻抗,基于支持向量机建立电阻抗数据的组织分类算法并验证算法的准确性,寻找不同组织电阻抗分类阈值。 方法 取离体脊柱组织,应用电化学分析仪采集10~100 kHz频率范围内皮质骨、松质骨、脊髓、肌肉、髓核的电阻抗。将两只猪采集的数据集分别作为训练集和测试集,应用主成分分析降维至二维数据,训练和验证基于支持向量机(SVM)建立的分类算法,应用集成学习的方法计算不同组织分类的电阻抗阈值。 结果 5种组织在10~100 kHz的测量频率内,电阻抗值差异有统计学意义(P<0.001)。应用主成分分析降维的数据集建立的支持向量机分类算法识别不同组织的准确率为100%。应用集成学习建立的多个分类器计算出了不同组织的电阻抗分类阈值。 结论 基于支持向量机可以实现脊柱术区组织电阻抗的准确识别,有望应用于临床协助医生提升组织识别准确率。