人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响

目的:研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖.实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果.方法:实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成.①对象:足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供,产妇与志愿者对实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:Percoll法分离脐血单个核细胞,贴壁纯化,达80%～90%融合时胰蛋白酶消化,按2.0×108L-1密度传代,取第4-5代细胞用于实验.密度梯度法分离外周血单个核细胞,以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109 L-1时加入尼龙棉柱内,用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞.脐血间充质干细胞分为2×108,1×108,0.5×108 L-1组,各100 μL接种于96孔培养板,加入2×108 L-1 T淋巴细胞悬液100 μL,再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化.以T淋巴细胞 植物血凝素为阳性对照.③实验评估:观察体外培养的脐血间充质干细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达.MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响.结果:①形态特征与表面抗原表达:原代培养10～18 d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞,即为脐血源性的间充质干细胞,传代7 d左右细胞达90%融合.流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13,CD29,CD44,CD166,不表达造血细胞系的表面抗原CD34,CD45.②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制:与阳性对照比较,经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制,增殖指数明显降低(P＜0.01).间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1,1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%,(34.47±3.09)%,(22.15±2.63)%.结论:脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,该抑制作用呈剂量依赖性.     

骨折后深静脉血栓形成患者的内源性抗凝能力评价

目的观察骨折后下肢深静脉血栓形成(DVT)患者的内源性抗凝能力及其在DVT形成中的作用。方法选择北京积水潭医院骨折后下肢DVT患者95例作为DVT组,体检健康者100例作为健康人对照组。收集患者术后第3天枸橼酸钠抗凝血浆标本,检测纤维蛋白降解产物(FDP)和D-二聚体(DD);用Thrombopath发色底物显色法检测内源性抗凝能力指标Protac凝血抑制率(PICI);收集患者血清检测高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。结果 DVT组FDP、DD均高于健康人对照组,差异均有统计学意义(P均0.01),DVT组PICI(%)低于健康人对照组(82.8±7.2 vs 87.8±3.6,P0.01);DVT组≥65岁患者较65岁患者PICI下降约4.8%(P0.05);当PICI的cut-off值为84.2%时,卡方检验显示,DVT与健康人对照组PICI阳性率差异有统计学意义(P0.01);相关性分析显示PICI与FDP、DD呈负相关,与HDL-C呈正相关(r分别为-0.318、-0.336和0.284,P均0.01);Logistic回归分析显示PICI是静脉血栓的危险因素,OR值为1.243(P0.01)。结论骨折后血栓患者的内源性抗凝能力降低。     

hTERT启动子调控p53基因表达逆转录病毒的抗肿瘤作用

目的：观察人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子驱动野生型p53的新型逆转录病毒对肿瘤的杀伤作用。方法：先将前期构建的逆转录病毒穿梭质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53进行包装，通过浓缩获得高滴度病毒液。然后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53感染包含突变型p53的大肠癌细胞系SW620，通过RT-PCR和Western blot证实p53mRNA和p53蛋白的表达。最后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53和pLHCX-hTERT-EGFP感染hTERT阳性的人大肠癌细胞株SW620，人肺癌细胞株A549和hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5，观察其特异性杀伤作用；另外通过裸鼠皮下注射肿瘤细胞SW620和A549，建立肿瘤模型，应用逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后测量肿瘤体积计算肿瘤生长抑制率。结果：获得病毒液的滴度分别为2.3×10^7CFU·mL^-1和3.5×10^7CFU·mL^-1。逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53经RT-PCR证实p53mRNA的表达，经Western blot检测到p53蛋白表达。重组逆转录病毒导入外源的野生型p53基因后，通过流式细胞检测到hTERT阳性人大肠癌细胞株SW620，人肺癌细胞株A549凋亡率远高于hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5（P〈0.05）。体内实验证实各组通过逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后的肿瘤体积明显小于对照组（P〈0.05）。结论：获得的新型逆转录病毒对肿瘤有特异性的杀伤作用。     

草分枝杆菌调节SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞生长周期的研究

目的探讨草分子杆菌对SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞系的抗增殖效应及调节细胞生长周期的作用。方法将SP-CA/Ⅰ人肺腺癌细胞株接种于细胞培养液(RPMI-1640)培养传代,分别加入不同浓度的草分子杆菌,作用36小后,分别以酶标仪检测细胞抑制率,倒置显微镜观察凋亡细胞形态变化,以cycletest plus DNA reagent kit标记,经FACSAria流式细胞仪检测细胞周期改变。结果①不同浓度的草分子杆菌体外对人肺腺癌细胞株SPCA/Ⅰ均有直接的抑制作用,其抑制率与所用药物浓度呈正相关。②倒置显微镜下可见细胞由原来贴壁生长而逐渐脱落、外形变圆、体积缩小、折光性增强,核染色质凝集,细胞裂解。③草分子杆菌体外能改变SPCA/Ⅰ人肺腺癌细胞株的细胞增殖周期,使细胞周期阻滞在G2~M期,细胞凋亡率明显增加。结论草分子杆菌能通过调节细胞增殖周期、诱导细胞凋亡,直接抑制人肺腺癌细胞株SPCA/Ⅰ增殖。     

靶向IGF-ⅠR的RNA干扰技术抑制胃癌细胞增殖的研究

目的 观察特异的小干扰RNAs(small interfering RNAs,siRNAs)对胃癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(Insulin-like growth factor-Ⅰ receptor,IGF-Ⅰ R)基因表达的抑制作用,研究其对肿瘤增殖的影响.方法 设计并体外合成2条靶向IGF-Ⅰ R的siRNAs,脂质体法瞬时转染MGC803细胞,转染前后均使用Western Blot法检测IGF-Ⅰ R的表达水平,MTT法检测细胞增殖,细胞计数并描记生长曲线.结果 MGC803细胞中有IGF-ⅠR的强烈表达.转染后48h,干扰组(siRNA2-L组、siRNA2-H组、siRNA1组)IGF-Ⅰ R表达抑制率分别为64.41%±4.11%、74.14%±6.15%、89.8%±4.10%;siRNA1组转染后第2-5天细胞增殖逐渐减少(分别达49.9%±1.2%、45.9%±4.4%、39.1%±5.1%、29%±4.0%);同期细胞计数分别为对照组的65.58%±4.89%、55.59%±0.82%、44.18%±3.17%、21.15%±1.1%.结论 特异的siRNAs可显著抑制胃癌细胞中的IGF-Ⅰ R基因的表达从而显著抑制细胞的增殖.     

自制枝莲清肝胶囊抑制乙型肝炎病毒活性的体外实验

目的观察枝莲清肝胶囊抑制乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法以HepG2.117细胞为模型,分为3组：空白对照组、枝莲清肝组（1000μg/ml）、拉米夫定组（5μg/ml）,用酶联免疫试验法（ELISA）检测细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg的变化,用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液中HBV DNA的变化,以MTT比色法观察药物对细胞的毒性作用。结果细胞毒性实验显示,2个药物组与空白对照组比较,OD值差异无统计学意义（P〉0.05）,表明2种药物对HepG2.117细胞的生长无毒性作用。枝莲清肝组24h和72 h对HBsAg的抑制率分别达30.1%和36.3%,对HBeAg的抑制率分别达6.4%和26.7%;PCR检测显示枝莲清肝胶囊能降低HBV DNA水平。除72 h时对HBsAg的抑制率低于拉米夫定组外（P〈0.05）,2组其余指标比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论枝莲清肝胶囊在1mg/ml浓度下有抑制HBV DNA和HBsAg、HBeAg的作用。     

In vivo and in vitro effects of QHF combined with chemotherapy on hepatocellular carcinoma

Objective： To investigate the synergistic anti-tumor effect of QHF （a Chinese medicine formula with anti- tumor active ingredients, including 800 mg/kg Cinobufotalin, 14 mg/kg Ginsenoside Rg3, 5.5 mg/kg Notoginseng and 100 mg/kg Lentinan） when combined with the chemotherapy drug cisplatin （DDP）. Methods： Hepatocellular carcinoma H22 cells were implanted into mice and after the transplants were successfully established the animals were divided into four groups, namely a normal saline（NS） control group, QHF group, DDP group and QHF＋DDP group. The tumor growth was monitored and the survival time determined. In vitro studies employing H22 cells used the first three groups, and determined the effects of QHF and DDP on tumor cell cycle distribution, apoptosis and morphologic changes in vitro. Results： QHF significantly inhibited the growth of tumors and prolonged the survival time of mice with hepatocellular carcinomas. QHF combined with DDP could attenuate DDP-induced leucopenia, spleen and thymus atrophy and other indicators of toxicity. The inhibition rate of tumor growth reached 82.54% with QHF＋DDP, and QHF prolonged the life span of DDP-treated mice by 66.83%. In the in vitro experiments tumor cells showed morphological changes characteristic of apoptosis by both light and transmission electron microscopy in the QHF group, and the apoptosis rate was 33.85%. Moreover, the proportion of cells in the G0/G1 phase was increased and those in the S-phase decreased. Conclusion： QHF combined with DDP could significantly inhibit tumor growth, induce the apoptosis of tumor cells and effectively attenuate DDP toxicity.     

乳鼠心肌裂解液对S180小鼠移植瘤抑瘤作用的实验研究

目的探讨乳鼠心肌裂解液对S180小鼠移植瘤生长的影响。方法提取制备乳鼠心肌细胞裂解液（car-diac muscle cell lysate of neonaterat,CMCLnr）,建立S180小鼠移植瘤模型,以顺铂组为阳性对照组,生理盐水为阴性对照组,CMCLnr再分别分为30mg/kg、60mg/kg、90mg/kg三个不同的剂量组腹腔给药,然后观察不同实验组对S180小鼠移植瘤生长的影响。结果各组小鼠移植瘤接种成活率均为100%。CMCLnr各剂量组肿瘤出现时间均晚于阴性对照组（P〈0.05）,实验各组肿瘤瘤重均小于阴性对照组,肿瘤抑制率DDP、CMCLnr（30mg/kg、60mg/kg、90mg/kg）分别为81.23%、63.09%、65.44%、66.06%,与阴性对照组比较。差异有统计学意义（P〈0.001）,且无明显剂量依赖性;CMCLnr各组的小鼠体重增加均大于生理盐水组,而顺铂组明显抑制小鼠生长（P〈0.05）。结论乳鼠心肌裂解液对S180小鼠移植瘤生长具有一定的抑制作用,且对小鼠无不良反应。     

氨基胍对人翼状胬肉成纤维细胞增殖影响的体外试验研究

目的:观察氨基胍(AG)对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响。方法:取人翼状胬肉标本进行体外贴壁细胞常规培养,传代至第3～5代细胞用于试验,以每孔1×104个细胞接种于培养板中,加入不同浓度(250、500、750、1000μmol.L-1)的AG作为AG组,另设不加AG的为对照组,检测作用24、48、72h后各孔的吸光度,并计算细胞增殖抑制率,每个时间点、每个浓度均设6个复孔。结果:人翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制率随AG浓度的增大和作用时间的延长明显升高(P<0.05)。结论:AG在受试浓度和受试时间范围内,对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞具有抑制作用且呈浓度、时间依赖性。     

眼镜蛇蛇毒中神经毒蛋白对PC-12细胞作用的初步研究

目的:研究眼镜蛇蛇毒中的神经毒蛋白对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞)的作用.方法:采用SP-SephadexC-25层析的方法分离出神经毒蛋白;MTT法检测神经毒蛋白对PC-12细胞的抑制率.结果:随着神经毒蛋白浓度的增加,对PC-12细胞的抑制率显著增加;随着时间的增长,对PC-12细胞的抑制率也明显增加....