艰难梭茵毒素基因3''''末端重复区域基因片段的PCR克隆

目的探寻一种简单、快速、灵敏的检测艰难梭菌的方法.方法以艰难梭菌毒素A和毒素B基因3'末端高度保守重复区分别设计一对引物,进行PCR反应,同时在同一体系相同反应条件下使用相同引物分别以大肠杆菌和乳杆菌DNA为模板进行扩增,比较二者结果.结果从艰难梭菌成功克隆了毒素A基因3'端重复区域960 bp的基因片段及毒素B基因3'端重复区域1851 bp的基因片段,不同来源的菌株出现了相同的2条电泳带,并通过测序鉴定;而对照的大肠杆菌和乳杆菌株无特异电泳带出现.结论从艰难梭菌毒素A、毒素B基因3'末端重复区域克隆的基因片段具有保守性,可以作为基因探针在临床上进行艰难梭菌检测,该方法简便、灵敏,可直接用粪便标本进行检测.此外,这些基因编码的多肽具有较高的疏水性并存在着膜受体结合区域,可以此为基础进行基因工程蛋白质疫苗的研究.     

细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建

目的：克隆细粒棘球蚴95（Eg95)抗原基因，构建携带目的基因的原核表达载体，为细粒棘球蚴抗原的免疫保护机制研究提供材料。方法：应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因，将其克隆至pUCm-T载体，测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET28上，根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆，通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序确定序列。结果：测序表明所有pET28-Eg95阳性克隆均为正确连接95抗原基因的重组质粒。结论：pET28-Eg95可以进一步用于重组蛋白的表达及抗细粒棘球蚴感染的实验研究。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

EST技术及其在基因全长cDNA克隆上的应用策略

随着人类基因组计划的顺利进行 ,EST技术被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的数据 ,从 ESTs即 c DNA的部分序列入手 ,通过同源筛选 ,获得基因部分乃至全长 c DNA序列 ,避免或减轻了构建与筛选 c DNA文库等繁琐的实验室工作。本文从原理、应用及其在科学研究上产生的影响等方面对EST技术进行了概述     

三利IL-15基因转染NCI-H446细胞模型的建立与鉴定

目的构建并鉴定三种IL-15基因转染的人小细胞肺癌(NCI—H446)细胞模型。方法PCR法扩增得原型IL-15基因片段(FhIL-15)、IL-15成熟肽基因片段(FhIL-15mp)和IL-2信号肽基因片段(FhIL-2sp)；利用重叠延伸基因拼接法将FhIL-15mp和FhIL-2sp拼接成改型IL-15基因片段(FhIL-2sp-hIL-15mp)。将三种IL-15基因片段(FhIL-15、FhIL-15mp和FhIL-2sp-hIL-15mp)分别插入真核表达载体pEGFPN1构建成相应的重组质粒(PhIL-15、PhIL-15mp和PhIL-2sp-hIL-15mp)，用脂质体法分别转染NCI-H446、G418筛选得三种IL-15基因转染的NCI-H446细胞(C-hIL-15、C-hIL-15mp、C-hIL-2sp-hIL-15mp)。对所得的各基因片段和重组质粒，用琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定；对所得的各转染细胞，用RT-PCR法检测hIL-15mRNA的表达，ELISA法检测hIL-15蛋白的分泌。结果琼脂糖凝胶电泳和测序证明，FhIL-15、FhIL-15mp、FhIL-2sp-hIL-15mp电泳条带位置和基因序列正确。三种转染细胞均有IL-15mRNA表达，但仅C-hIL-2sp-hIL-15mp可测到22pg/mL的IL-15蛋白分泌。初步应用表明，三种转染细胞确有不同的免疫生物学特性。结论正确构建了三种IL-15基因转染的NCI—H446细胞模型，可在进一步研究IL-15基因与肿瘤细胞免疫生物学特性的关系及至机制中应用。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体（Flt3 LIg and，FL），并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA，通过RT-PCR技术，扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段，经DNA测序证实后，将得到的片段基因插入pcDNA3．0表达载体，构建了pcDNA3．0-FL真核表达载体；将重组质粒pcDNA3．0-FL转染CHO细胞．经G418筛选出阳性细胞克隆，扩大培养，提取细胞总蛋白，用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3．0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-FL并在CHO细胞中成功表达，为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。     

EST技术及其在基因全长cDAN克隆上的应用策略

随着人类基因组计划的顺利进行，EST技术被广泛应用基因识别、绘制基因表达图普、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的，从ESTs即cDNA的部分序列入手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA库等繁锁的实验室工作。本从原理、应用有其在科学研究上产生的影响等方面对EST技术进行了概述。     

先天性板层白内障X性连锁显性遗传一家系

先证者（Ⅳ8） 女，3岁，因“双眼视力差1年”于2003年12月就诊，患儿系第1胎足月顺产，其母妊娠期间无发热，皮疹等疾病史，双眼视力检查不合作，裂隙灯生物显微镜检查双眼均为先天性板层白内障，对称，无眼球震颤，双眼B超未发现异常，双眼A超显示：右眼角膜曲率K1，K2分别为7.85mm和7.27mm，眼轴22.60mm,左眼角膜曲率K1，K2分别为7.91mm和6.82mm，     

莱姆病螺旋体60kD抗原的基因克隆及表达

利用质粒ｐＡＴ１５３为载体，构建了莱姆螺旋体全细胞ＤＮＡ基因文库，用菌落原位固相酶斑法从文库中初选出一株表达６０ｋＤ抗原的克隆子，命名为ｐＬＷ２２７。经免疫印迹分析、核酸杂交、连续亚克隆分析，证明此重组菌株表达了莱姆螺旋体６０ｋＤ抗原，编码该抗原的基因表达单位为２．２ｋｂ或更小，位于莱姆螺旋体的染色体上。该抗原的表达为进一步研究莱姆病的致病机理打下了基础。