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71.
目的探讨工程菌表达的耐热DNA聚合酶的纯化方法。②方法收集IPTG诱导带有耐热DNA聚合酶(TD聚合酶)基因表达质粒的工程菌株DH-TD4,用溶菌酶裂解,60℃处理后,上清液用硫酸铵沉淀,根据溶解度差异进行粗分级,然后进行离子交换层析细分级,并经聚合酶链式反应(PCR扩增)鉴定其活性。③结果纯化的TD聚合酶具有良好的聚合活性。④结论溶解度差异与离子交换层析是工程菌表达的耐热DNA聚合酶纯化的主要步骤。基因工程制备的DNA聚合酶可用于PCR检测 相似文献
72.
Methodological Studies on Genomic DNA Extraction and Purification from Plant Drug Materials 总被引:17,自引:0,他引:17
本文探讨了菊科9种植物和地胆草的4种对口商品药材基因组DNA提取与纯化的原理、方法通过对3种常用植物基因组DNA提取方法(CsCl梯度超速离心法、CTABCsCl梯度超速离心法和CTAB微量提取法)的条件摸索在DNA产率、纯度以及提取纯化过程中影响PCR扩增因子方面进行比较,认为CTAB微量提取法是植物类药材基因组DNA一种比较省时、有效、经济的提取方法 相似文献
73.
建立兔乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)分离纯化的新方法,研究该酶的动力学特性。采用Blue Dexteran和Sepharose 4B交联制成Blue Dextran-Sephaqrose 4B染料配体亲和层析柱,结合QAE-Sephadex A450离子交换层析分离兔LDH-C4,以作图法测定该酶动力学数据。 相似文献
74.
目的:建立Bre1及Rad6的表达和纯化方法,构建Bre1-Rad6的复合物,寻找复合物的结晶条件,为使用X射线晶体学的方法解析复合物的结构奠定基础。方法:使用大肠杆菌表达系统表达蛋白质;使用共纯化的方法组装复合物;使用气象扩散的方法结晶复合物。结果:建立了来源于Lodderomyces elongisporus的Bre1(LeBre1)氮端与Rad6相互作用的结构域(RBD)和Rad6(LeRad6)在大肠杆菌中大量表达的方法;通过使用共纯化的方法,成功组装了LeBre1 RBD-Rad6复合物,并进一步通过两步凝胶过滤层析纯化的方法精细纯化,获得了纯度超过95%的蛋白复合物;使用气象扩散的方法结晶复合物,在18℃通过对1 000多个结晶条件的筛选,确定了复合物的两种结晶条件,进一步对该条件优化,获得了质量相对较好的晶体。结论:成功的构建了LeBre1 RBD-Rad6复合物的表达、纯化和结晶的方法,为使用X射线晶体学方法解析复合物的结构奠定了基础。 相似文献
75.
抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究将构建的抗人CD3单链抗体基因,克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导表达GST-ScFv融合蛋白,并以SDS-PAGE分析,在Mr为52000左右出现一条新生蛋白带,表达量约占菌体总蛋白的40%。经初步纯化和复性后,用GST亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗人CD3ScFv,竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有CD3亲和活性 相似文献
76.
目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础. 相似文献
77.
人内质网分子伴侣BiP的克隆、表达及其在RA患者血清抗体检测中的作用 总被引:1,自引:0,他引:1
以类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者滑膜组织文库cDNA为模板,用PCR方法扩增得到1965 bp人内质网分子伴侣BiP的全长cDNA,将其克隆入OmicsLinkTM表达载体pReceiver-B01a,构建重组表达质粒pReceiver-B01a-BiP。重组表达质粒导入大肠杆菌BL-21(DE3)菌株中诱导表达目的蛋白,表达产物以Ni+-NTA agarose层析柱纯化。SDS-PAGE和免疫印迹法(Western blot)分析发现,表达产物以可溶性蛋白和包涵体形式共同存在,表达量约占菌体蛋白总量的20%~30%。相对分子质量约为80000,纯度达到电泳级。经免疫印迹法鉴定,获得的BiP重组蛋白可以与RA患者血清反应,检测的抗BiP抗体在RA患者血清中的阳性率为75.4%(49/65),明显高于系统性红斑狼疮(systemic lupus erythe-matosus,SLE)患者14.6%(7/48)、原发性干燥综合征(primary Sj gren’s syndrome,pSS)患者7.3%(4/55)及正常人0%(0/71)(P<0.01)。表明,经原核表达获得的BiP全长蛋白,RA患者血清抗体可以很好结合,有望应用于临床血清学诊断。 相似文献
78.
目的:利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子,并利用镍金属螯合层析法进行纯化,探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法:采用RT-PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的cDNA,将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析,并利用镍金属螯合层析法进行纯化。^3H-TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果:利用pQE30表达载体表达的含6个组氨酸尾的vasostafin蛋白,在SDS-PAGE上表现出一条约2lkD的阳性条带,经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。结论:人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性. 相似文献
79.
人绒毛膜滋养层细胞的分离纯化及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的建立一种简便易行、经济有效的纯化培养滋养层细胞的方法.方法:取孕6-8w的正常绒毛组织10例,采用胰蛋白酶消化法分离细胞,将细胞随机分为两组(各5例),一组用淋巴细胞分层液进行纯化,另一组未纯化,最后用含15%胎牛血清的培养基培养细胞.用免疫细胞化学法进行细胞纯度鉴定.结果本纯化的细胞阳性率为(68.6 2±2.69)%,纯化后的细胞阳性率为(91.60±1.55)%,两者之间的差异具极显著性意度( P<0.001).结论该法简便易行,经济有效,可获得纯度较高、合乎试验要求的细胞滋养层细胞. 相似文献
80.