蝎镇痛活性肽AS的一个二硫键对镇痛活性的影响

目的研究蝎镇痛活性肽AS中二硫键C12-C62对其生物活性的影响。方法利用一步聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别用Ser替代蝎镇痛活性肽AS中第12位、第62位及第12位和第62位的Cys,从而构建其3个突变体。采用金属离子螯合亲和层析方法对表达突变体蛋白进行纯化。采用小鼠扭体法测定3个突变体的镇痛活性。结果构建了3个突变体质粒,在BL21(DE3)中实现了可溶性表达。采用金属离子螯合层析方法获得了电泳纯样品。其镇痛活性明显低于Bmk AS(P<0.01)。结论3个突变体与rBmK AS镇痛活性有明显差异,二硫键C12-C62与蝎毒镇痛活性密切相关。     

抗人小细胞肺癌嵌合T细胞受体基因的构建

众所周知，T细胞受体(TCR)识别抗原与抗体识别抗原是不同的。前者识别的是抗原——主要组织相容性抗原的复合物，受MHC限制，而后者则是识别天然状态下的抗原，亲和力较强。考虑到TCR可变区部位与抗体可变区部位有众多相似之处，即其均由两条二硫键相连的多肽组成，TCR由阿尔法(α)、贝塔(β）链组成，     

二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析

目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b)。测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体。IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用。结果双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右。复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,最大杀伤率可达96%。该蛋白在37℃孵育16h后,仍能保持大部分活性。结论所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

预先形成的重链二硫键有助于HLA-A2-抗原肽复合物体外折叠

目的: 提高可溶性HLA -A2 肽复合物体外折叠效率。方法: 在变性非还原条件下提取原核表达的HLA重链(HC)。通过离子交换及硫酸铵沉淀初步纯化后, 在β2微球蛋白(β2m)及特异性抗原肽 (Try369-377 )存在的情况下, 于pH6. 6的折叠缓冲体系中稀释复性。利用Westernblot及ELISA检测折叠产物。结果: 折叠复合物中主要含有HLA-A2 抗原肽复合物和β2m, 较少含有HC聚合体; 折叠效率较传统方法提高 2. 5倍。结论: 通过与传统方法作比较, 证实此法折叠效率比传统方法高, 为进一步HLA 肽四聚体及人工抗原提呈细胞的制备可提供足够可溶性的HLA -A2 肽单体。     

外源蛋白在大肠杆菌中的折叠

大肠杆菌是表达外源基因最常用的宿主之一。它结构简单 ,遗传背景清楚 ,基因表达调控机制相对明确。随着对分子伴侣和折叠酶研究的深入 ,蛋白在大肠杆菌内的折叠机制逐渐为人们所认识。外源蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达问题也逐步得到解决     

前阳离子脂质体的构建及有关性质研究

目的 制备前阳离子脂质体并考察其相关性质.方法 化学合成含二硫键的胆固醇衍生物(2-[[4-[(羟甲基)二硫]-1-亚氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸胆固醇酯,CHETA);薄膜分散-膜挤压法制备空白前阳离子脂质体;以鱼精蛋白缩合质粒DNA再与空白前阳离子脂质体作用,形成载基因前阳离子脂质体;粒度电位测定仪测定前阳离子脂质体的粒径和Zeta电位,电镜观察形态;考察在二硫键还原酶二硫苏糖醇的作用下前阳离子脂质体Zeta电位变化情况;以LacZ为报告基因转染HepG2细胞,X-gal原位染色定性观察,并定量测定β-半乳糖苷酶活性和总蛋白含量计算转染效率.结果 前阳离子脂质体形态近似于球体,平均粒径为145.8 nm(PDI=0.086),Zeta电位为-33.83 mV,载基因前阳离子脂质体转染肝癌细胞HepG2转染效率为12.18 mU&#183;mg-1 protein,是裸质粒的10.5倍.结论 二硫键修饰的前阳离子脂质体是具有发展潜力的非病毒载体.     

抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段抗体dsFv VL链的构建、表达和鉴定

目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a( ),于工程菌BL21star(DE3)中表达及TALON柱芯亲合纯化,通过ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果dsFv VL链的Thr21替换为Cys,扩增出基因片段长约为650bp,经BL21star(DE3)菌表达出相对分子质量约为28×103的目的蛋白,与NH-LBP具有一定的结合力。结论抗体轻链中成功引入了Cys。     

MALDI-TOF-MS在奥曲肽结构分析中的应用

目的:应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对奥曲肽进行结构确证分析。方法:采用二巯基苏糖醇还原奥曲肽二硫键,碘代乙酰胺(IAM)封闭还原奥曲肽中的巯基,测定还原前后及烷基化奥曲肽相对分子质量,并应用源后衰变(PSD)对其进行序列分析。结果:奥曲肽、还原奥曲肽和烷基化奥曲肽相对分子质量测定值分别为1019.25,1021.24,1135.38,与 PSD 测定的序列相同,均和理论值一致。结论:本方法可以较快速分析奥曲肽结构,是此类多肽结构确证的有效方法。     

人源抗HBs靶向干扰素融合基因表达与鉴定

目的用抗体工程技术研制乙型肝炎人源抗HBs靶向干扰素。方法在已有的抗HBs dsFv的基础上,用重叠延伸PCR的方法将抗HBs dsFv VL基因和ɑ干扰素基因连接,形成融合基因。为避免干扰素（IFN）与dsFv空间折叠的影响,其间引入15个氨基酸的柔性短肽;分别构建重链VH基因、轻链VL-IFN融合基因的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达载体,转染CHO。结果从细胞培养上清中检测到有抗病毒活性的IFN存在,活性单位为20000 U/ml;有抗HBsAg活性,D490为1.60,dsFv具有与抗原的结合活性。结论成功表达了既有抗HBs活性又有干扰素活性的融合蛋白,本研究为研制乙肝靶向干扰素奠定了基础。