抗基质金属蛋白酶-2单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

目的:制备和鉴定基质金属蛋白酶-2(MMP-2)单克隆抗体(mAb),检测其在人卵巢癌组织和裸鼠移植瘤中的表达.方法:利用戊二醛法制备人工抗原MMP-2-BSA和MMP-2-KLH,并免疫小鼠,采用标准杂交瘤技术,亚克隆筛选出单克隆细胞株,制备腹水,采用辛酸-硫酸铵法纯化mAb.以ELISA、Western blot法对抗体进行鉴定.通过免疫组织化学法与商品化多抗进行对比,并联合CA125将自制抗体应用于临床人卵巢癌组织和裸鼠移植瘤的检测.结果:人工抗原MMP-2-BSA和MMP-2-KLH合成成功.获取3株稳定分泌抗MMP-2的杂交瘤细胞株(3G10、4D12、1E8),抗体亚型均为IgG1.其中3G10反应性最强.经间接ELISA法检测纯化后抗体的效价达1∶1×106.自制mAb应用于人卵巢癌组织切片和裸鼠模型检测,卵巢癌组织与正常组织之间表达差异有统计学意义(P＜0.01).卵巢癌患者CA125和MMP-2联合检测阳性率较单一检测高(P＜0.01).自制mAb的染色特性与商品化抗体相似,且检出率较商品化多抗高(P＜0.01).结论:采用人工合成多肽作为免疫原成功制备了与卵巢癌相关的特异性抗MMP-2 mAb.     

RNA干扰联合长春新碱对U937细胞体内外生长的影响

目的 从体外和体内两个方面探讨慢病毒载体介导小发卡shRNA(short harpin RNA,shRNA)靶向沉默同源盒A10(homeoboxA10,HOXA10)基因联合长春新碱（Vincristine,VCR）对U937细胞增殖和凋亡的影响。方法 将U937细胞分为干扰（KD）组、阴性对照（NC）组、空白对照（BC）组,经Western blot方法测定对HOXA10基因的沉默作用;MTT法检测各组细胞的IC50;流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测各组细胞的凋亡率;通过流式细胞仪分选出干扰组和阴性对照组绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）阳性的细胞,建立裸鼠AML皮下移植瘤模型（细胞活力>90%）,计算干扰组的抑瘤率。结果 流式细胞仪测得慢病毒对U937细胞的感染率>90%,干扰组HOXA10的蛋白水平为较BC组下降89.78%。下调HOXA10的表达水平可降低VCR对U937细胞的半数抑制浓度（half-inhibitory concentration,IC₅₀）,提高VCR诱导的U937细胞凋亡率,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。体内实验：干扰组肿瘤组织增长受到抑制。结论 慢病毒载体介导的RNA干扰下调HOXA10的表达水平可在体外和体内增强U937细胞对VCR的敏感度。     

Celecoxib对肺癌细胞的辐射增敏实验研究

目的 建立裸鼠非小细胞肺癌(NSCLC)H460细胞动物模型,观察环氧化酶2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布(Celecoxib)对H460放疗的增敏作用,并对其作用机理进行初步探讨。方法 建立Balb/c裸鼠肿瘤模型。动物随机分成3组:对照组、放疗组、塞来昔布+放疗组。灌肠法给予塞来昔布16mg/kg/d,4周时对比两组肿瘤瘤重;免疫组化方法分析共济失调-毛细血管扩张症突变蛋白(ATM)和表皮生长因子受体(EGFR)表达变化。结果 4周时塞来布昔+放疗组与放疗组的抑瘤效果比较有显著差异(P < 0.05)。结论 塞来昔布可能通过提高ATM和EGFR的表达,增强H460细胞的放疗敏感性,将来可能具有较好的临床应用价值。     

人肝癌裸鼠NKG2D受体的表达及对NK细胞毒活性的影响

目的 通过研究原发性肝癌中NK细胞的细胞毒活性变化及其活化性受体NKG2D的表达,观察肝脏和脾脏组织病理变化,探讨NK细胞免疫抑制机制,为原发性肝癌的免疫治疗提供理论依据。方法 ①建立人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型：先用人肝癌细胞株Hep3B接种于裸鼠皮下,形成皮下移植瘤,然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内,建立肝原位移植瘤模型（间接肝原位移植瘤模型）;②检测裸鼠原发性肝癌对NK细胞免疫活性的影响：分离裸鼠外周血、肝脏及脾脏组织NK细胞,LDH方法检测NK细胞的细胞毒活性,流式细胞技术检测不同组织NK细胞NKG2D表达百分率,H-E染色观察肝脏移植瘤对肝脏和脾脏淋巴细胞的影响。结果 ①外周血、肝脏及脾脏的NK细胞毒活性及NKG2D受体表达随着肿瘤生长逐渐下降,其中肝脏NK细胞毒活性及NKG2D表达下降明显;②荷瘤裸鼠肝脏癌组织与皮下瘤相同,癌组织异型性与时间呈正相关,脾脏淋巴小结在第4周增生明显,第8周小梁结构增多。结论 原发性肝癌通过下调NKG2D的表达,对NK细胞有免疫抑制作用,这种作用主要发生在肝脏,但对外周血和脾脏也有影响。     

枸杞多糖对胎儿卵巢组织冷冻保存的影响

背景：抗氧化剂的应用对于提高卵巢组织冻存后的活力起着很重要的作用。 目的：通过观察冷冻保存的胎儿卵巢组织异种移植到裸鼠肾被膜下的发育情况,探索枸杞多糖在卵巢组织冷冻保存中的作用。 方法：实验分为4组。①新鲜移植组：取材后的新鲜胎儿卵巢组织直接进行移植。②冻存对照组：冷冻保护液为基液。③β-巯基乙醇组：冷冻保护液为基液添加100 μmol/L β-巯基乙醇。④枸杞多糖组：冷冻保护液为基液添加 400 mg/L枸杞多糖。对冷冻复温后的胎儿卵巢皮质块进行祼鼠的肾被膜下移植,并于移植后12周取材。 结果与结论：各组在移植物的存活率上差异无显著性意义(P > 0.05)。在卵泡计数上冷冻对照组最低(P < 0.05)。在卵泡的存活率上,各组间差异均有显著性意义,其中以冷冻对照组最低,枸杞多糖组最高。β-巯基乙醇组和枸杞多糖组卵巢超微结构较冷冻对照组保存的好。提示400 mg/L的枸杞多糖和100 μmol/L的β-巯基乙醇有利于卵巢组织的冷冻保存,并可显著提高冷冻卵巢组织移植后的存活率。     

罗格列酮抑制卵巢癌生长的体内外实验研究

目的:探讨罗格列酮(RGZ)对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞生长的抑制作用。方法:应用噻唑蓝法(MTT)检测RGZ对卵巢癌细胞增殖的影响;应用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色观察细胞凋亡形态学变化;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RGZ对SKOV3细胞PPARγ、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表达的影响;建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型,分为RGZ治疗组及对照组,观察RGZ对移植瘤体积和重量变化的影响。结果:①MTT法检测不同浓度RGZ组(1、10、50、100、200μmol/L)细胞生长抑制率与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),并呈浓度依赖性抑制;②DAPI荧光染色发现,RGZ作用24小时后,细胞核浓缩,着色较深呈亮蓝色,部分细胞核破裂呈碎片状或多边形;③RT-PCR检测发现,不同浓度RGZ(10、50、100μmol/L)作用于SKOV3细胞24小时后PPARγ、Caspase-3 mRNA表达水平上调,而Bcl-2 mRNA表达水平下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);④细胞接种26天后,RGZ各用药组(4、12、60、120mg/kg)裸鼠移植瘤体积增长缓慢,其抑瘤率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:RGZ可明显抑制SKOV3细胞的生长,诱导其凋亡,并呈浓度依耐性,通过激活PPARγ-Bcl-2-Caspase-3细胞凋亡信号通路而实现抑制肿瘤细胞生长的作用。     

荷人卵巢上皮癌裸鼠冻融卵巢组织移植的效果评价

目的:获取人卵巢上皮癌裸鼠原位移植瘤癌旁正常卵巢组织,经安全筛查并冻融后移植至去势裸鼠体内,探讨移植后效果,为临床应用提供依据。方法:将人卵巢上皮癌OVCAR3细胞种植于裸鼠皮下以获取瘤源,并进行卵巢原位移植,建立卵巢癌原位移植瘤模型,解剖裸鼠获取癌旁正常卵巢组织。癌旁组:取筛选后的癌旁卵巢组织进行玻璃化冷冻,复苏后分别进行皮下及原位移植,各20例;对照组:同龄正常裸鼠卵巢组织,皮下移植及原位移植各20例;去势裸鼠组:20只同龄去势裸鼠;正常卵巢组:20只同龄正常裸鼠。移植12周后,分析各组裸鼠卵巢组织内卵泡形态及激素分泌功能。结果:40只人卵巢上皮癌裸鼠原位移植瘤模型中共获取35份活检正常的癌旁卵巢组织,获取率87.5%(35/40)。玻璃化冷冻前后卵巢组织中卵泡形态及各级卵泡比例均无显著差异(P>0.05),癌旁冷冻组织和癌旁新鲜组织的异常卵泡比例差异无统计学意义(P>0.05),冷冻组织以初级卵泡及次级卵泡等窦前卵泡为主。癌旁组皮下移植组织存活率80%(16/20),对照组皮下移植组织存活率90%(18/20),癌旁组原位移植组织存活率90%(18/20),对照组原位移植组织存活率95%(19/20)。移植后组织内卵泡以次级卵泡及窦状卵泡为主,各级卵泡的形态及构成比和未移植的同龄正常裸鼠卵巢相似(P>0.05);癌旁组卵泡数明显低于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01);皮下移植和原位移植组织内的各级卵泡数差异无统计学意义(P>0.05)。癌旁组卵泡刺激素水平明显低于去势裸鼠组,而雌二醇水平明显高于去势裸鼠组(P<0.01);癌旁组卵泡刺激素水平明显高于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01),而雌二醇水平明显低于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01);皮下移植和原位移植的卵泡刺激素水平和雌二醇水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:癌旁卵巢组织冻融移植后有正常卵泡发育及激素分泌功能;皮下移植和原位移植均可取得较好的效果;癌旁卵巢组织冻融移植有望作为卵巢上皮癌患者治疗后恢复卵巢内分泌功能的有效手段。     

子宫内膜异位症裸鼠模型的研究进展

子宫内膜异位症(EMs)是育龄妇女的常见病,发病机理不明,对受试患者缺乏适宜试验是令研究迟滞的重要原因之一.利用裸鼠等动物模型能够研究EMs形态学特征、黏附、血管形成机理及药物作用疗效,有重要应用价值.综述不同月经周期、不同部位的EMs或在位内膜在裸鼠模型中的生长情况,以及不同种植部位、不同体外条件对异位灶形成的影响,雌孕激素及其受体、基质金属蛋白酶、血管生成因子在EMs发病中的作用机理,并简要介绍利用动物模型探讨EMs新型治疗药物的应用研究.     

裸鼠脾脏移植瘤模型在NGX6抗结肠癌转移作用研究中的应用

目的:建立结肠癌肝转移模型,为抑瘤基因NGX6功能研究提供体内试验平台.方法:将低分化结肠癌细胞系HT-29组(HT-29)、空白质粒转染组[pcDNA3.1( )/HT-29]、NGX6转染组[(pcDNA3.1( )/NGX6/HT-29)]细胞分别接种于裸鼠脾脏下极包膜内,每天称量裸鼠体质量并观察裸鼠摄食、活动及精神情况,45 d后处死裸鼠,分别从大体水平以及镜下观察肝、脾、肺、肾、脑等器官肿瘤转移情况.结果:pcDNA3.1( )/NGX6/HT-29组裸鼠较其他两组裸鼠肝脏转移灶数目明显减少、脾脏上种植瘤形成明显减少.结论:抑瘤基因NGX6抑制结肠癌HT-29细胞的转移,裸鼠脾内种植转移模型可作为新基因体内功能研究的理想模型.