HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性测定系统的研究进展

NS3/4A丝氨酸蛋白酶是理想的抗HCV靶位之一.缺乏有效的细胞培养系统和小动物模型是抗HCV药物筛选和评价的瓶颈,基于酶建立的测定系统常被用作筛选和鉴定抗HCV药物.关于NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的测定系统已经有很多报道,本文从细胞内测定和体外测定系统两方面综述如下.     

抑肽酶捡了芝麻丢了西瓜?

抑肽酶（aprotinin）是数十年前就用于治疗胰腺炎的老药，1986年经英国国家心肺研究所（National Heart and Lung Institute）的心外科医师研究证实，抑肽酶为非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，可抑制Ⅻ因子的激活，抑制纤溶，保护血小板Ⅱa／mb蛋白，手术开始缓慢给予200万KIU抑肽酶后，每小时给予50万KIU，体外循环预充液中加入200万KIU，可使体外循环下心脏直视手术的失血量减少46％左右。1993年抑肽酶经拜尔医药保健有限公司引进我国，随后，国产抑肽酶问世。自20世纪90年代，国内外越来越多地将大剂量抑肽酶应用于体外循环下心脏手术和大出血的手术，主要目的是减少术中出血量，其应用已经被列入许多国家的临床规范，也不乏严谨研究支持其安全性。不仅如此，还有许多实验和试验表明，给予上述大剂量抑肽酶还可以有效地抑制炎性反应，保护缺血器官，本期发表的抑肽酶器官保护效应的文章，亦属此类。     

激活Wnt/β-catenin通路促进肝癌细胞上皮间充质转化

探讨丝氨酸精氨酸蛋白激酶1（SRPK1）对肝癌细胞株HepG2上皮间充质转化（EMT）的作用。方法 通过Ualcan及TIMER 2.0数据库分析SRPK1 mRNA在肝细胞癌（LIHC）与正常样本、配对癌旁样本之间的表达差异,与生存时间、临床分期、病理分期、TP53变异、人种、性别、年龄、体重等临床资料的关系。用HPA数据库的免疫组化数据验证SRPK1蛋白在LIHC组织及正常对照间的表达差异。构建SRPK1过表达及抑表达的HepG2细胞,并根据SRPK1表达差异分为SRPK1组及对照的Vector组,shRNA组及对照的Scramble组。Western blot检测4组细胞株SRPK1的蛋白水平。Western Blot、免疫荧光检测EMT分子标记物E-cadherin、Vimentin蛋白表达差异。核浆蛋白分离比较细胞β-catenin入核程度的变化。GEPIA2数据库分析在LIHC组织中SRPK1与Wnt/β-catenin通路下游基因Twist、MYC、MMP9的相关性,Real-time PCR验证SRPK1对Twist、MYC、MMP 9表达的影响。结果 SRPK1表达在LIHC组织中表达显著高于正常对照及配对癌旁样本（P＜0.05）,随疾病分期及病理分级增加而增加（P＜0.05）,高表达SRPK1组总生存期低于低表达组（P=0.035）,LIHC患者TP53突变组SRPK1表达高于非突变组（P＜0.05）,在不同种族、性别、年龄、体重间无差别（P＞0.05）。SRPK1过表达HepG2细胞E-cadherin表达下降,Vimentin表达增加（P＜0.05）;抑表达细胞E-cadherin增加,Vimentin下降（P＜0.05）。SRPK1在LIHC组织中分别与Twist、MYC、MMP9表达呈正相关性（P＜0.05）;SRPK1过表达细胞β-catenin蛋白在细胞核中表达增加（P＜0.05）,Twist、MYC、MMP9表达增加（P＜0.05）;反之,抑表达细胞β-catenin在细胞核中表达下降（P＜0.05）,Twist、MYC、MMP9表达减少（P＜0.05）。结论 SRPK1可能通过Wnt/β-catenin通路促进HepG2细胞EMT活化     

急性心肌梗死患者PCI术后血浆vaspin、periostin及Lp-PLA2水平对不良心血管事件的预测价值

目的 探讨急性心肌梗死(AMI)患者经皮冠状动脉介入术(PCI)后血浆腹腔脂肪型丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)、骨膜蛋白(periostin)及脂蛋白相关磷脂酶A₂(Lp-PLA₂)水平对不良心血管事件(MACE)的预测价值。方法 选取2019年3月至2021年3月医院收治的260例行PCI手术AMI患者,统计术后1年内MACE发生率,并根据是否发生MACE将其分为发生组和未发生组,单因素分析AMI患者PCI术后发生MACE的影响因素,logistic回归分析AMI患者PCI术后发生MACE的影响因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析血浆vaspin、periostin及Lp-PLA₂对AMI患者PCI术后发生MACE的预测价值。结果 260例AMI患者,在行PCI术后1年内MACE发生率为9.62%(25/260)。两组年龄、高血压病史、疾病类型、左心室射血分数(LVEF%)、入院血糖、肌酐、三酰甘油(TG)、发病至治疗时间(OTN)、心肌梗死溶栓治疗(TIMI)分级、vaspin、periostin及Lp-PLA...     

微小牛蜱凝血酶抑制剂的分离纯化与活性研究

从半饱吸血的微小牛蜱(Boophilusmicroplus)唾液腺中分离纯化到了一种凝血酶抑制剂,用飞行质谱测定该抑制剂的分子量为6752Da,不同于已知的从蜱类来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂。这是世界上首次报道的从微小牛蜱唾液腺分离出来的凝血酶抑制剂。该抑制剂对凝血酶表现强烈的抑制活性,对激活的第X因子和胰蛋白酶具有微弱的抑制活性。     

丝裂原活化的蛋白激酶及其在病理性痛发生中的作用

1、MAPK的概述 丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen—activated protein kinases，MAPKs）是一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，为真核生物所特有，是一类在进化中高度保守的酶。它参与细胞内部许多方面的调节，将胞外刺激转化为胞内的转录和翻译后反应，从而将细胞表面的受体同胞内关键的调节目标联系起来，在细胞信号传导通路中发挥关键的作用0i-3]。在哺乳动物细胞中，有三个MAPK家族成员已经得到比较清楚的描述，     

丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型在人肺腺癌组织表达上调并促进肺腺癌细胞的增殖

目的探讨肺腺癌组织丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型(SPINK1)表达与生存时间的关系及其对肺腺癌细胞生长的影响。方法用Real-time PCR法、免疫组织化学法检测285例肺腺癌组织和癌旁组织SPINK1的表达,并分析其表达水平与临床病理特征及预后的关系。利用SPINK1慢病毒表达载体及小干扰RNA(si RNA),处理人肺腺癌细胞系,光学显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,ELISA或Real-time PCR检测SPINK1表达水平,细胞计数和集落形成法检测肺腺癌细胞生长情况。结果肺腺癌组织SPINK1 mRNA和蛋白表达均上调(均P0. 0001),SPINK1高表达组患者总生存时间短于低表达组(50. 0个月vs 64. 5个月,P0. 001)。SPINK1过表达组,肺腺癌细胞上清液SPINK1蛋白高表达(P 0. 05),增殖与克隆形成能力均上调(P 0. 05);SPINK1敲减组,肺腺癌细胞SPINK1 mRNA表达下调,增殖能力下调(P0. 05)。结论肺腺癌组织SPINK1高表达提示患者预后不良; SPINK1促进人肺腺癌细胞的增殖。     

PI3-K/Akt信号通路对骨髓源性心肌干细胞分化的调控作用

目的研究磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Akt)信号通路在骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)向心肌细胞分化中的调控作用,探讨MCSCs向心肌细胞分化的信号转导机制。方法利用单克隆培养技术从SD大鼠骨髓中筛选MCSCs,用BMP-2诱导其向心肌细胞定向分化,通过免疫细胞化学标记和Western blotting检测BMP-2诱导后细胞内p-Akt水平的变化,并通过RT-PCR检测心肌早期转录因子和心肌特异基因的表达。结果BMP-2诱导前MCSCs内p-Akt水平较低,诱导后渐增强,20~30min达高峰,1h后逐渐降低。用PI3-K抑制剂Ly294002预处理细胞后,p-Akt水平明显降低。RT-PCR检测显示,诱导前MCSCs的Nkx2.5和GATA-4呈低表达,诱导后2周表达增强,4周表达更加明显。cTnT和Cx-43 mRNA在诱导前未见表达,诱导后2周表达明显,4周表达增强。用Ly294002处理后,细胞的Nkx2.5、GATA-4和cTnT、Cx-43 mRNA的表达显著降低,细胞形态变化不明显。结论BMP-2能诱导MCSCs向心肌细胞分化,PI3-K/Akt信号通路在BMP-2诱导MCSCs向心肌细胞分化中发挥重要的调控作用。     

精-甘-天冬-丝氨酸4肽对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的: 探讨精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS) 4肽对纤维连接蛋白(FN)刺激的肝星状细胞(HSCs)增殖、凋亡及caspase-3表达的影响。方法: 应用体外HSCs培养技术, 采用[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入法测定HSCs增殖;膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术、TUNEL、扫描电镜及透射电镜等方法测定HSCs凋亡;采用甲苯胺兰染色方法测定细胞粘附率;应用流式细胞方法测定caspase-3蛋白表达。结果: ①25 mg·L^-1、50mg·L^-1、100mg·L^-1浓度RGDS 4肽剂量、时间依赖性抑制HSCs增殖, P＜0.01。②RGDS 4肽对HSCs凋亡的诱导作用亦呈剂量和时间依赖关系, P＜0.01。扫描电镜、透射电镜观察, RGDS 4肽组出现典型的凋亡征象。③RGDS 4肽作用于HSCs 2 h, 25 mg·L^-1、50mg·L^-1、100mg·L^-1组粘附抑制率分别是8.82%、29.41%、45.59%, 而RGES 4肽组的粘附抑制率仅为4.41%, P＜0.01。④RGDS 4肽处理组caspase-3表达明显高于FN、RGES 4肽组。结论: RGDS 4肽剂量和时间依赖性抑制HSCs增殖并诱导其凋亡。RGDS 4肽抑制增殖及诱导凋亡效应, 依赖于caspase-3, 也与其抗粘附作用有关。     

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段.方法:采用PCR技术从含人MASP1 cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性.结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和860 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合.结论:获得了表达人MASP1 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1 N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件.