miR-449b表达与原发性肝细胞癌预后的关系

目的探讨原发性肝细胞癌患者外周血中微小RNA(miR)-449b的表达水平及其与预后的关系。方法选取2013年1月至2015年1月行根治切除术的98例原发性肝细胞癌患者作为观察组,选取同期30例健康体检者作为对照组。用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测研究对象外周血中miR-449b的表达水平。对观察组患者进行随访,截止时间为2019年10月,观察患者总生存期(OS),分析miR-449b的表达与OS的关系。结果观察组外周血中miR-449b表达水平为(0.25±0.09),低于对照组的(0.59±0.12),差异有统计学意义(t=16.674,P<0.01)。共90例患者获得随访,死亡49例。Kaplan-Meier联合Log-rank检验显示,miR-449b低表达组OS短于miR-449b高表达组(P<0.05)。Cox分析结果显示,miR-449b低表达、年龄大、TNM分期高是影响原发性肝细胞癌患者OS的独立危险因素(P<0.05)。结论原发性肝细胞癌患者外周血中miR-449b表达下调,且miR-449b表达降低与较短的OS有关,血miR-449b的检测可能成为有效的原发性肝细胞癌预后标志物。     

CD 133 and CXCR4 colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis

Introduction

Colorectal cancer (CRC) stem cells or tumor-initiating cells (Co-TIC) are implicated in both cancer recurrence and extranodal metastasis. CD133 and CXCR4 are specific cell surface markers that are indicators of Co-TIC. The presence of lymph node (LN) metastases is one of the strongest negative prognostic factors for CRC patients. We examined the relationship between the Co-TIC markers CD133 and CXCR4 and LN involvement in CRC.

Methods

CRC cells were isolated via enzymatic digestion. CD133⁺, CXCR4⁺, and double-positive CRC cells were detected by fluorescence-activated cell sorting analysis. The percentages of CD133⁺, CXCR4⁺, and double-positive cells were identified and correlated to the number and percentage of positive LN on staging.

Results

Twenty-seven samples underwent fluorescence-activated cell sorting analysis. The mean percentage of CD133⁺ cells was 3.94% (range 0.15%–19.06%). The mean percentage of CXCR4⁺ cells was 6.15% (range 0%–27.11%). The mean percentage of CD133⁺CXCR4⁺ cells was 0.45% (range 0%–2.08%). Thirteen patients had LN metastasis: 8 N1 disease and 5 N2 disease. The correlation coefficients between the percentage of Co-TIC marker–positive cells and percentage of positive LN were r = 0.58 (P = 0.0016) for CD133⁺ cells, r = 0.36 (P = 0.5868) for CXCR4⁺ cells, and r = 0.56 (P = 0.0022) for double-positive cells.

Discussion

Our results show CD133⁺ and CD133⁺CXCR4⁺ cancer cells correlate with the presence of LN metastasis in CRC. Further studies will examine whether these markers can give consistent prognostic information and may help to develop novel diagnostic and therapeutic options.     

25例恶性胶质瘤中肿瘤干细胞的分离与检测

目的 从不同病理级别胶质瘤组织标本中分离、培养并鉴定胶质瘤干细胞.方法 取25例(23例原发胶质瘤,2例复发胶质瘤)新鲜人脑胶质细胞瘤标本,分离脑肿瘤细胞,接种于含生长因子的无血清达尔伯克(氏)必需基本培养基/F-12(DMEM/F-12)培养基中培养至细胞形成干细胞球,免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞CD133、Nestin的表达情况,干细胞球诱导分化后检测细胞表面分化标记物β微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达情况.结果 被检测的23例原发胶质瘤标本中,随着胶质瘤级别的增高,形成神经球的时间缩短,数量增多.2例复发胶质瘤组织分离得到的细胞形成的神经球较原发胶质瘤快而多.免疫荧光方法检测神经球CD133、巢蛋白(Nestin)表达阳性.神经球细胞经诱导分化后β-TubulinⅢ、GFAP表达阳性.结论 胶质瘤组织中存在肿瘤干细胞,不同级别胶质瘤中BTSC数量及增殖能力不同.     

微小RNA-29b-1*和微小RNA-29c对膀胱癌T24细胞增殖的影响

目的 观察微小RNA(miR)-29b-1*和miR-29c对膀胱癌T24细胞的活性和增殖的影响.方法 构建携带目标miRNAs干扰基因的慢病毒(pGCsil-H1-CMV-GFP)载体、阳性克隆的聚合酶链反应(PCR)鉴定.用293T细胞包装慢病毒形成慢病毒重组体,并用孔稀释法测定滴度.T24细胞中转染慢病毒重组体及转染效率测定.用噻唑蓝(MTT)比色法对4组处于对数生长期的实验组[空细胞对照组、转染阴性对照慢病毒细胞组、转染miR-29b-1*基因RNA干扰(RNAi)慢病毒细胞组、转染miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组]进行连续5d的细胞增殖分析.结果 实时定量PCR(Real-time PCR)验证结果显示:T24细胞中miR-29b-1 *和miR-29c表达水平比较于空细胞组分别为3.47和4.40;MTT比色法显示,转染阴性对照慢病毒细胞组与空细胞对照组细胞比较,增殖受到轻度抑制;而转染miR-29b-1*、miR-29c基因RNAi慢病毒细胞组与染阴性对照慢病毒细胞组和空细胞对照组细胞比较,增殖均受到明显抑制,前者抑制效果更明显.结论 细胞增殖MTT法分析显示通过RNAi降低miR-29b-1*、miR-29c的表达均能引起T24细胞的增殖抑制.     

miR-24-3p靶向KLF6基因调控IL-6/STAT3信号通路影响食管癌细胞的活力和凋亡

目的:探讨微小RNA-24-3p(miR-24-3p)对食管癌细胞活力和凋亡的影响及机制。方法:以人正常食管上皮细胞HEEC为对照,采用RT-qPCR检测食管癌细胞TE11、Eca109和EC9706中miR-24-3p和KLF6 mRNA的表达,Western blot检测KLF6蛋白的表达。用anti-miR-24-3p和KLF6 siRNA转染EC9706细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测检测细胞中与增殖、凋亡相关的蛋白以及IL-6/STAT3信号通路相关蛋白的表达,ELISA法检测IL-6的表达。双萤光素酶报告基因实验验证miR-24-3p与KLF6靶向调控的关系。结果:食管癌癌细胞TE11、Eca109和EC9706中miR-24-3p表达上调(P<0.05),KLF6的mRNA和蛋白表达下调(P<0.05)。敲减EC9706细胞miR-24-3p表达可抑制其细胞活力,诱导其凋亡,并抑制细胞CDK4、cyclin D1、CDC25A、p-STAT3、IL-6及Bcl-2的表达,促进caspase-3和Bax的表达。结论:miR-24-3p可靶向KLF6基因调控IL-6/STAT3信号通路影响食管癌细胞的生长和凋亡。     

miR-485-5p靶向作用于SOX5抑制肝癌细胞Hep3B的活力及侵袭和迁移能力

目的:研究微小RNA-485-5p(miR-485-5p)对肝癌细胞的活力及迁移和侵袭能力的影响及其潜在机制。方法:以正常肝细胞THLE-3为对照,采用RT-qPCR检测肝癌细胞中性别决定区Y框蛋白5(SOX5)mRNA和miR-485-5p的表达,Western blot检测SOX5、增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达水平,MTT法检测Hep3B细胞的活力,Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,双萤光素酶报告基因系统验证细胞中miR-485-5p与SOX5的调控关系。结果:与对照组相比,在肝癌细胞Hep3B、Huh7和HCCLM3中miR-485-5p的表达水平显著降低(P<0.05),SOX5的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);过表达miR-485-5p可抑制Hep3B细胞的活力及迁移和侵袭能力(P<0.05);miR-485-5p靶向调控SOX5的表达,敲减SOX5的表达也可抑制Hep3B细胞的活力及迁移和侵袭能力;过表达SOX5可部分逆转过表达miR-485-5p对Hep3B细胞活力及迁移和侵袭能力的抑制作用(P<0.05)。结论:miR-485-5p通过靶向调控SOX5基因抑制Hep3B细胞的活力及迁移和侵袭能力,有望成为肝癌诊断和治疗的潜在分子靶点。     

微小RNA-186-5p对肾癌细胞增殖与侵袭能力的影响

目的 观察微小RNA-186-5p（MiR-186-5p）对肾癌细胞侵袭和增殖的影响并探讨可能存在的机制。方法 培养正常肾小管上皮细胞系HK-2、原代及转染MiR-186-5p的肾癌细胞（Caki-2细胞）,Real-time PCR检测MiR-186-5p的水平,细胞计数试剂盒8（CCK-8）法评估各组细胞的存活率,Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力,Western blotting检测磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）水平。结果 肾小管上皮细胞系Hk-2和转染了MiR186-5p的Caki-2细胞的MiR186-5p水平均显著高于Caki-2细胞（P<0.05）。HK-2细胞和Caki-2细胞的存活率接近100%,而转染了MiR-186-5p的Caki-2细胞的存活率显著降低至72.86%（P<0.05）。 与HK-2细胞的迁移数目相比,Caki-2细胞迁移较多（P<0-05）;转染MiR-186-5p的Caki-2细胞迁移较少（P<0.05）。与HK-2细胞内Akt和mTOR分子磷酸化水平相比,Caki-2细胞内Akt和mTOR分子磷酸化水平显著增加（P<0.05）;而转染了MiR-186-5p的Caki-2细胞内Akt和mTOR分子的磷酸化水平有所下降（P<0.05）。结论 MiR-186-5p能够有效抑制肾癌细胞的侵袭与增殖,可能与其抑制Akt/mTOR信号通路的激活相关。     

miR-301a-3p对大鼠星形胶质细胞Cx43转录后的靶向调控作用

目的:研究大鼠星形胶质细胞中微小RNA-301a-3p(miR-301a-3p)对缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的靶向调控作用及其作用位点。方法:合成miR-301a-3p agomir和miR-301a-3p antagomir,转染至星形胶质细胞,Western blot检测各组细胞中Cx43蛋白的表达情况;构建重组载体wt-pEZX-MT05-Cx43和mut-pEZX-MT05-Cx43,采用双萤光素酶报告基因实验验证miR-301a-3p的靶基因;构建表达载体pcDNA3.1-Cx43,通过回复实验分析miR-301a-3p对细胞凋亡的影响。结果:将miR-301a-3p agomir转染到星形胶质细胞后,Western blot检测显示,与对照组相比,Cx43蛋白表达显著降低(P<0.05)。双萤光素酶报告基因实验结果表明,miR-301a-3p能够与Cx43的3′-UTR结合,对其表达产生负调控;将不含Cx43 3′-UTR的重组载体pcDNA3.1-Cx43转染星形胶质细胞后,能够回复miR-301a-3p对Cx43蛋白表达的负调控作用,引起细胞凋亡。结论:Cx43是miR-301a-3p的一个靶基因,miR-301a-3p通过作用于Cx43 mRNA的3′-UTR而抑制其在大鼠星形胶质细胞中的表达。     

心肌特异性miR-133a与cTnT早期诊断急性心肌梗死的价值

目的 比较血循环中心肌特异性miR-133a与肌钙蛋白T（cTnT）在急性心肌梗死（AMI）早期诊断中的价值.方法 收集67例AMI患者和32名非AMI对照者的血浆标本,通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测定血浆中miR-133a水平,同时通过电化学发光法检测血浆cTnT的变化.结果 AMI患者血浆中miR-133a水平较非AMI对照者明显升高（P〈0.01）,而当这些AMI患者康复出院时miR-133a水平已回落到基线.MiR-133a水平的波动与研究对象的自身特征无相关性（P＆gt;0.05）.受试者工作特征曲线（ROC）分析表明,miR-133a在早期诊断AMI方面具有显著的心肌特异性和敏感性,但并不优于cTnT.结论 血浆miR-133a可作为AMI早期诊断的标志物,但在诊断价值上并不优于cTnT.     

4-羟基他莫昔芬通过抑制DNMT1/DNMT3A表达逆转三阴性乳腺癌细胞间质表型

目的 探讨4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)能否通过上调微小RNA-200c（microRNA-200c,miR-200c)表达抑制DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）1和DNMT3A,从而逆转三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）细胞间质表型。方法 采用Western Blot检测雌激素受体-α(estrogen receptor-α,ER-α)、孕激素受体（progesterone receptor,PR)及人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2),DNMT1,DNMT3A,Vimentin和Actin蛋白的表达。采用实时荧光定量PCR技术检测miR-200c的相对表达量。应用网络数据库及在线分析软件预测miR-200c启动子的CpG岛。结果 不同表型乳腺癌细胞miR-200c表达差异显著;4-OHT上调TNBC细胞miR-200c表达;miR-200c启动子存在CpG岛;4-OHT能够上调miR-200c影响DNMT1/DNMT3A表达。结论 TNBC细胞miR-200c表达降低,4-OHT能够上调TNBC细胞中miR-200c表达。4-OHT通过上调间质样TNBC细胞miR-200c表达,抑制DNMT1、DNMT3A表达,从而逆转间质样表达。