绿原酸对缺氧环境下干细胞来源软骨样细胞凋亡的影响

目的探讨缺氧环境下绿原酸对骨髓间充质细胞来源软骨样细胞(Chondrogenic MSCs)影响及机制。方法采用体外培养大鼠间充质干细胞,以含0.2 mg.L-1 BMP-2诱导液培养12 d使其成为软骨样细胞后进行实验。分为(A)正常对照组、(B)绿原酸组、(C)0.1%O2缺氧环境组、(D)绿原酸+0.1%O2缺氧环境组。检测各组Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡、细胞内活性氧水平;RT-PCR检测不同组软骨细胞Caspase-3和Bcl-2基因的表达。结果与正常对照组比较,0.1%O2缺氧环境12 h能明显造成干细胞来源软骨样细胞的凋亡(P<0.05),绿原酸可降低0.1%O2缺氧引起的软骨样细胞凋亡率(P<0.05),活性氧水平下降,Bcl-2表达增强,Caspase-3表达减弱。结论绿原酸可抑制0.1%O2缺氧引起的软骨样细胞凋亡,其作用机制可能与降低细胞内的活性氧水平,稳定细胞的氧化还原状态来保护线粒体膜电位,促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达及抑制Caspase-3的表达有关。     

不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性

目的 观察不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性，为软骨组织工程提供理想的种子细胞，方法 将2周齿的新西兰大白兔软骨细胞置盖玻片上进行原代和传代培养，同时，把相应代数的软骨细胞种植于明胶海绵上，应用倒置显微镜和电镜观察不同代数细胞形态学变化和增殖能力。以及不同代数软骨细胞种植于支架后的生长和黏附情况，应用HE染色鉴别及免疫组化观察Ⅱ型胶原的分泌情况。结果 （1）软骨细胞在体外单层培养，传5代后细胞形态由多角形变成梭形，逐渐丧失表型。（2）第4代软骨细胞在单层培养时，增殖能力最强，分泌功能旺盛。（3）传代细胞贴壁时间短于原代。（4）第4代软骨细胞种植于支架上形成软骨细胞-支架复合体所需的时间最短，软骨细胞于海绵支架上的黏附最紧密。结论 软骨细胞在体外培养第4代左右可以作为组织工程的最佳种子细胞，其形成的软骨细胞-支架复合体的质量最佳，时间最短。     

永生化软骨细胞体内软骨形成的实验研究

目的　探讨以永生化软骨细胞作为种子细胞构建和形成软骨的可能性。方法　把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)导入兔髁状突软骨细胞 ,G418筛选 ,挑选阳性克隆扩增培养 ;实验组将扩增培养的转染细胞与细胞支架材料 β 磷酸三钙 ( β TCP)复合 ,对照组将正常软骨细胞与 β TCP复合或单纯 β TCP在体外培育后种植于裸鼠皮下 ,3和 6个月取材进行组织学和免疫化学检测 ,并与对照 1组和对照 2组进行比较。结果　实验组和对照 1组可见复合体包裹软骨样组织 ,对照 2组有少量纤维样组织形成。免疫组化染色显示 ,实验组番红“O”、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色呈强阳性 ,有明显软骨组织形成 ,与对照组有显著性差异 (P <0 0 1) ,对照 1组染色呈弱阳性 ,对照 2组则为阴性。结论　永生化软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞 ,具有较好的软骨形成能力     

3种可注射性支架体内构建组织工程软骨的比较研究

目的比较以纤维蛋白封闭剂(FS)、P luron ic-F 127(PF)、透明质酸(HA)3种可注射性支架体内构建组织工程软骨的效果。方法常规分离、消化、体外单层培养新生兔软骨细胞,分别将软骨细胞与3种支架材料混合接种于裸鼠皮下,并于第10周取材通过大体观察,湿重测定,GAG含量测定和组织化学检查来判断体内形成软骨的能力。结果三组均可形成软骨样组织块,其中FS组体积最大,质地较硬,表面光滑,软骨细胞位于成熟的陷窝中,阿尔新兰及Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性;PF组体积中等,质地柔韧,陷窝清楚,可以检测到阳性的阿尔新兰及Ⅱ型胶原表达。HA组只形成很小的组织块,硬度较差,含有的细胞数和分泌的基质最少,三组的GAG含量分别为(8.8±0.4)m g/g,(6.8±0.3)m g/g,(4.2±0.3)m g/g,各组间差异具有显著性(P<0.05,n=3)。结论3种可注射性支架中,FS成软骨作用最强,PF较好、HA组最差,FS和PF可以用于组织工程软骨的构建。     

p38 MAPK and COX2 inhibition modulate human chondrocyte response to TGF-beta.

These studies compare actions of p38 MAPK inhibition and COX2 inhibition to modulate human arthritic chondrocyte responses to TGF-beta and FCS under basal and IL-1 activated conditions. Chondrocytes isolated from arthritic human femoral condyle cartilage obtained at total knee replacement were grown to 80% confluence. Proteoglycan synthesis and proliferation were measured with and without IL-1 activation in the presence and absence of growth factors and with and without inhibition of p38 MAPK or COX2 activity. Experiments to evaluate TIMP-1 production under these conditions were done using cartilage organ cultures. Neither p38 MAPK inhibitors nor COX2 inhibition affected basal proliferation. However both inhibitors enhanced the proliferative response to TGF-beta and FCS in IL-1 activated chondrocytes. TGF-beta stimulated proteoglycan synthesis was decreased by p38 MAPK inhibition, however COX2 inhibition restored the response to TGF-beta in IL-1 activated cells. In contrast, COX2 inhibition did not modulate TIMP-1 production while p38 MAPK inhibitors potentiated TGF-beta stimulated production of TIMP-1 in IL-1 activated cartilage. p38 MAPK inhibition and COX2 inhibition have unique and similar abilities to counteract some of the effects of IL-1 on human chondrocyte/cartilage metabolism. Both will partially restore the proliferative response to growth factors. p38 MAPK inhibition blunts TGF-beta stimulation of proteoglycan synthesis, but increases TIMP-1 synthesis. COX2 inhibition can restore the proteoglycan synthetic response to TGF-beta, but has no effect on cartilage TIMP-1 production. Use of these inhibitors to minimize cartilage damage in arthritic and mechanically stressed joints should reflect these characteristics.     

关节软骨细胞库

本文介绍了关节软骨细胞的分离、冷冻保存和复苏技术，并在阐明胶原酶的细胞毒性作用的基础上，提出了分阶段消化法，以减少分离细胞的损伤，由于低温保护剂ＤＭＳＯ也具有细胞毒性，因而应尽量缩短ＤＭＳＯ与软骨细胞在４℃以上的接触时间。降温和复温速度是影响细胞存活的关键因素。降温速度从４℃～－８０℃以Ｉ℃／ｍｉｎ为佳，之后迅速投入－１９６℃的液氮中长期保存，细胞复苏应采用３７℃水浴快速复温法，虽然检测冻存细胞的存活率可采用苔盼蓝拒染试验，但最可靠的方法是细胞培养，利用关节软骨细胞库进行细胞培养、电镜观察和激光流式细胞计量分析，结果证明冻存软骨细胞复苏后仍具有正常的结构和形态并保持新陈代谢和自我复制功能。     

膝骨关节炎脂肪垫对关节软骨细胞的影响

目的:观察人膝骨关节炎(OA)脂肪垫对正常及OA关节软骨细胞的影响。方法:24例人膝脂肪垫和膝关节软骨均由骨科手术室提供,12例为膝关节急性外伤手术患者,12例为膝OA患者行关节置换术后。切取正常及OA膝脂肪垫行苏木精-伊红染色(HE)及瘦素免疫组织化学染色;用OA膝脂肪垫制作脂肪垫培养液(FCM);于急性膝外伤手术标本的表面完整处提取正常软骨细胞,于膝OA关节置换术标本提取OA软骨细胞,分别进行体外培养并鉴定,随机分成正常组、OA组、正常+FCM组及OA+FCM组,其中正常组和OA组均加入完全高糖培养基,正常+FCM组和OA+FCM组均加入FCM,对各组细胞进行形态学观察,于第14天将各组软骨细胞予Ⅱ型胶原(COL2)免疫组化染色及油红O染色,同时应用Western blot技术检测各组软骨细胞中COL2、聚蛋白多糖(Acan)和基质金属蛋白酶(MMP-13)的表达情况。结果:(1)COL2免疫组化染色:OA组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度比正常组显著降低(P0.05)。与OA组相比,正常+FCM组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度无明显差异,而OA+FCM组显著降低(P0.05)。与正常+FCM组相比,OA+FCM组软骨细胞内的COL2免疫组化染色平均吸光度显著降低(P0.05)。(2)油红O染色:OA组软骨细胞内的油红O染色平均吸光度与正常组相比差异无统计学意义。与OA组相比,正常+FCM组和OA+FCM组软骨细胞内的油红O染色平均吸光度均有增高(P0.05),但OA+FCM组增高更为显著(P0.05)。(3)Western blot结果:OA组COL2、Acan的表达水平低于正常组(P0.05),而MMP-13的表达高于正常组(P0.05)。与OA组相比,正常+FCM组COL2、Acan和MMP-13的表达水平无明显差异;相较于正常组及正常+FCM组,OA+FCM组COL2、Acan的表达水平降低(P0.05),而MMP-13的表达水平增高(P0.05)。结论:OA膝FCM能使正常及OA软骨细胞形态上发生脂肪样变,并通过代谢途径提高软骨细胞MMP-13的表达,加速软骨细胞COL2、Acan的降解,且对OA软骨细胞的破坏更为显著。     

Age-independent effects of hyaluronan amide derivative and growth hormone on human osteoarthritic chondrocytes

Aim: Increased age is the most prominent risk factor for the initiation and progression of osteoarthritis (OA). The effects of human growth hormone (hGH) combined or not with hyaluronan amide derivative (HAD) were evaluated on human OA chondrocytes, to define their biological action and potentiality in OA treatment.

Material and methods: Cell viability, metabolic activity, gene expression and factors released were tested at different time points on chondrocytes treated with different concentrations of hGH (0.01–10?μg/ml) alone or in combination with HAD (1?mg/ml).

Results: We found that OA chondrocytes express GH receptor and that the different doses of hGH tested did not affect cell viability, metabolic activity or the expression of collagen type 2, 1, or 10 nor did it induce the release of IGF-1 or FGF-2. Conversely, hGH treatment increased the expression of hyaluronan receptor CD44. HAD combined with hGH reduced metabolic activity, IL6 release and gene expression, but not the suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2), which was significantly induced and translocated into the nucleus. The parameters analyzed, independently of the treatments used proportionally decreased with increasing age of the patients.

Conclusions: hGH only induced CD44 receptor on OA chondrocytes but did not affect other parameters, such as chondrocytic gene markers or IGF-1 or FGF-2 release. HAD reduced all the effects induced by hGH partially through a significant induction of SOCS2. These data show that GH or HAD treatment does not influence the response of the OA chondrocytes, thus the modulation of cellular response is age-independent.     

脱矿牙本质基质骨诱导性及对相关细胞鉴定的实验研究

目的 探讨脱矿牙本质基质（DDM）诱导成骨机制的细胞理论框架和成骨方式。方法 在24只新西兰大耳白兔双侧竖脊肌区制备4个肌袋位点,随机选取3个位点为实验位点,植入DDM,另一位点为对照位点,不植入任何材料。术后1、2、3、4、8、12、16和20周处死动物,制作组织标本,应用苏木精-伊红（HE）染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和免疫组织化学染色对间充质干细胞、成骨细胞、软骨细胞及破骨细胞进行鉴定分析。结果 HE染色显示：3周时,实验组可见软骨样基质、骨样基质和成骨样细胞。免疫组化染色显示：各时间点CD44、碱性磷酸酶（ALP）和Ⅱ型胶原表达有统计学意义（P<0.05）。结论 DDM具有良好骨诱导性和组织相容性,其诱导成骨的主要方式可能为软骨内成骨。     

姜黄素对IL-1β体外诱导兔关节软骨细胞分泌IL-8、sICAM-1和NO、PGE_2的影响

目的:研究姜黄素对兔软骨细胞体外诱导分泌白介素8(IL-8)、sICAM-1和一氧化氮(NO)、前列腺素(PGE2)的影响。方法:将10μg/L浓度的白介素1β(IL-1β)分别与低、中、高浓度的姜黄素共育于兔关节软骨细胞,用IL-1β体外诱导兔软骨细胞分泌IL-8、sICAM-1和NO、PGE2,采用ELISA法检测兔软骨细胞分泌IL-8和sICAM-1的量,分别采用硝酸还原酶法和ELISA酶联免疫竞争法测定细胞上清液NO含量和PGE2含量。结果:IL-1β(10μg/L)组兔软骨细胞分泌的IL-8和sICAM-1较空白对照组升高,姜黄素对IL-1β诱导分泌的IL-8和sICAM-1起抑制作用,同时其对IL-1β诱导产生的NO、PGE2也起抑制作用。结论:姜黄素可显著抑制IL-1β刺激兔软骨细胞分泌促炎症因子IL-8和sICAM-1,并可显著抑制NO、PGE2途径,对软骨细胞具有一定的保护功能。