人骨髓间充质干细胞的体外培养及睫状神经节神经营养因子诱导其向神经元样细胞分化的研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(h-MSCs)体外培养条件及睫状神经节神经营养因子(CNTF)对h-MSCs向神经元样细胞分化的影响.方法 采用梯度离心法和全骨髓法相结合,利用含血清的DMEM/F12培养基培养h-MSCs,以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h后再以不同浓度CNTF诱导,传至第3代时h-MSCs开始向神经元样细胞方向分化.应用免疫细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定.结果 h-MSCs在体外培养条件下能保持旺盛的增殖能力,CNTF诱导后细胞形态发生明显改变,伸出突起,类似神经元;免疫细胞化学法检测显示CD44、CD54以及诱导后神经元特异性蛋白(NSE)和巢蛋白(nestin)均呈阳性表达.10 ng/mL 实验组NSE阳性细胞占细胞总数的(42.42±1.39)%,nestin阳性细胞占细胞总数的(45.36±1.60)%.结论 h-MSCs可在体外扩增、培养.h-MSCs经bFGF预诱导后再经CNTF诱导可向神经元样细胞方向分化.10 ng/mL为CNTF的最适诱导浓度.     

显微分离培养与免疫磁珠法分离纯化人毛囊干细胞

目的 探讨从人毛囊隆突区细胞(bulge cells,BCs)获取高纯度有活性的人毛囊干细胞(hair folliclestem cells,HFscs)的方法及条件. 方法 取自愿捐献的成人头皮标本,显微分离培养获得BCs,应用免疫磁珠纯化BCs中CD200阳性的HFSCs.苔盼蓝染色比较纯化前后细胞活性;流式细胞仪检测细胞纯化效率;免疫荧光检测纯化前后细胞CD200的表达情况. 结果 显微分离培养获得的人毛囊BCs,培养6 d后细胞生长融合,呈铺路石样.所得细胞角蛋白19组织化学染色阳性.CD200免疫磁珠分选法纯化细胞后,苔盼蓝染色显示纯化前细胞活力为95.0%±0.6%,纯化后为94.2%±1.0%,差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪及免疫荧光检测显示纯化前CD200阳性细胞的纯度为8.31%,纯化后CD200阳性细胞纯度为82.31%,纯化后CD200阳性细胞回收率为65.39%. 结论 联用显微分离培养与免疫磁珠法,可获得高纯度HFSCs,且细胞活性不受影响.     

PI3K在BCR／ABL阳性细胞中促进细胞周期进程和抗凋亡的作用

BCR／ABL阳性细胞中，磷酯酰肌醇-3-激酶（P13K）途径是BCR／ABL激活的一条重要途径，它对于BCR／ABL阳性细胞恶性表型的维持是必不可少的。现对PI3K在BCR／ABL阳性细胞中促进细胞周期进程和抗凋亡的作用和机制作一综述。     

胎鼠皮质神经元细胞核的制备和鉴定

目的 建立制备皮质神经元细胞核的方法，以便用于核移植研究。方法 （1）采用胎龄17d的胎鼠进行皮质神经元的分离培养，用抗MAP2和NeuN免疫细胞化学法进行鉴定；（2）用梯度离心法制备神经元细胞核，并用HE染色、免疫荧光染色、透射电镜检查等方法进行鉴定，用台盼蓝染色检测其活性。结果 （1）胎鼠皮质神经元呈多角形，伸出多个突起，MAP2染色显示神经元细胞浆和突起呈免疫反应阳性，NeuN染色显示神经元细胞核呈免疫反应阳性，部分核周胞质和部分近端突起也呈免疫反应阳性，MAP2和NeuN阳性细胞比例均在90％左右；（2）HE染色和Hoechst33342免疫荧光染色显示神经元梯度离心后在22％～30％Ficoll400梯度层可见到大量圆点状细胞核，台盼蓝染色显示活细胞核比例为99．6％；在22％～30％Ficoll400梯度层细胞透射电镜标本中可观察到圆形的细胞核，在细胞核的周围仅见到一层薄薄的胞浆成分。结论 梯度离心法是制备皮质神经元细胞核的可靠方法。     

低温保存神经干细胞移植促进脊髓损伤后轴突再生的实验研究

目的:观察低温保存(-70℃)的神经干细胞(NSCs)复苏后移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后轴突再生的影响.方法:NSCs在处于对数生长期阶段冻存2周,复温后由5-溴脱氧尿嘧啶核苷法(Brdu)标记,制备大鼠SCI模型.实验分为3组:NSCs移植组(A组)、DMEM填充组(B组)、正常对照组(C组).脊髓损伤后立即进行移植干预,应用免疫组化法观察Brdu标记的移植细胞的存活及迁移情况,应用辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪法观察损伤处轴浆运输的重建.结果:复苏的NSCs经Brdu标记后移植到SCI区,在损伤脊髓区域可检测到标记的阳性细胞,辣根示踪技术显示细胞移植组较DMEM填充组阳性细胞明显多,组间差别有统计学意义.结论:低温保存的NSCs在移植到脊髓损伤区域后可存活,并参与脊髓损伤处轴浆通路的结构重建.     

乳腺大汗腺癌的形态学与免疫表型特征

目的 观察乳腺大汗腺癌(apocrine carcinoma，AC)的形态学和免疫表型特征，并探讨其诊断标准。方法 对HE染色片中显示有大汗腺细胞学特点的30例乳腺癌标本进行组织学观察和免疫组化S—P法检测，并选取5例大汗腺化生(apocrine metaplasia，AM)及2例大汗腺腺病(apocrine adenosis，AA)和AA伴导管原位癌(DCIS)1例标本作对照组。使用的-抗包括GCDFP—15、Mucin—1、AR、ER、C—erbB-2、Ki-67。结果 ①8例被确定为AC，均为高核级，其中大汗腺导管原位癌(ADCIS)1例、ADCIS伴浸润性大汗腺癌(IAC)5例，IAC伴导管原位癌(DCIS)2例。镜下AC细胞的共同特征为：细胞大，胞界清，胞质丰富，深嗜伊红染，颗粒状；核大、圆，核仁常大而突出。依据胞质形态可分为：A型，胞质深伊红染，有数量不等的清晰颗粒；B型，胞质内大量细空虚的小泡，可聚呈泡沫状，类似组织细胞或皮脂腺细胞；C型，胞质浅染、均质，如细磨砂玻璃样；②8例AC与5例AM及2例AA均共同表达GCDFP—15、AR、Mucin—1及Ki-67；除1例外，ER均不表达；③AC的GCDFP—15的表达与大汗腺化生不同：前者呈胞质内弥漫颗粒或空泡状，表达有异质性；后者阳性颗粒聚成小球状团簇，位于细胞质的核上区。④AR平均阳性细胞数在Ac及AM分别为33．4％及93．8%；Ki-67平均阳性细胞数在AC及AM分别为52．4％及40％。结论 AC的诊断须具备3项标准：①HE细胞形态成分90％以上符合Ac型细胞；②GCDFP—15阳性，阳性细胞数占癌细胞总数50％以上；⑧AR阳性，阳性细胞数大于癌细胞总数20％。     

宫内缺氧对幼年大鼠神经干细胞增殖及学习记忆能力的影响

目的 探讨宫内缺氧对幼年大鼠海马神经干细胞的增殖及学习记忆能力的影响.方法 孕SD大鼠20只随机分为对照和缺氧组各10只.将缺氧组大鼠置三气培养箱内缺氧,制作缺氧性脑损伤新生鼠模型;对照组不进行缺氧.缺氧和对照组幼年大鼠生后30 d进行Morris水迷宫实验,水迷宫实验结束的当天取脑组织、固定,常规石蜡切片(经海马),Nestin免疫组织化学染色神经干细胞.在200倍显微镜下观察其海马齿状回Nestin阳性神经干细胞.采用SPSS14.0软件包进行组间t检验.结果 缺氧组大鼠海马齿状回Nestin阳性细胞吸光度(0.16±0.10)较与对照组(0.15±0.09)明显增加(t=3.24 P＜0.01);在目标象限,缺氧组大鼠搜索时间[(18.91±6.18) s,(14.70±3.56) s]均较对照组[(26.42±2.66) s,(20.76±4.44) s]明显缩短(t=5.0,4.77 Pa＜0.01).结论 一定时间、一定水平的宫内缺氧可刺激幼年大鼠海马神经干细胞的增殖,幼年大鼠的学习和记忆能力明显下降.     

内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管:最适比例验证

目的:由内皮前体细胞分化的内皮细胞与成熟平滑肌细胞联合培养可以为组织工程血管的形成提供更接近天然的条件.实验拟进一步证明两种细胞联合培养可促进血管内皮细胞生长,以及两种细胞的最适比例.方法:实验于2006-01/2007-05在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.①实验材料:新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院,产妇知情同意.②实验方法及评估:从人脐动脉中用组织块培养法分离并原代培养血管平滑肌细胞,免疫荧光方法鉴定其平滑肌肌动蛋白表达情况;采用密度梯度离心法分离脐血中的内皮前体细胞,经体外定向诱导分化和免疫荧光方法鉴定其表型;无菌条件下制作Ⅰ型胶原凝胶,在其上以3:1～4:1的比例混匀联合培养内皮前体细胞与平滑肌细胞,并观察两种细胞联合培养时的形态,分析两种细胞最合适的种植比例;免疫荧光方法观察在Ⅰ型胶原凝胶联合培养中CD31、vWF的表达以及内皮细胞的生长情况.结果:①原代培养的平滑肌细胞呈典型"波峰谷"形态,荧光染色平滑肌肌动蛋白呈阳性.②脐血来源的内皮前体细胞定向诱导分化为内皮细胞后,呈现出"铺路石"样形态,表达CD31、vWF,结合荆豆凝集素,提示具备成熟内皮细胞特性.③在Ⅰ型胶原凝胶上两种细胞增殖力均旺盛,与平滑肌细胞以3:1～4:1的比例种植在I型胶原凝胶培养一段时间后,内皮前体细胞可从平滑肌细胞处得到支持,形成血管样网络结构.④共培养1周后,CD31与vWF阳性细胞即内皮前体细胞分化而来的内皮细胞互相连接,形成环形结构.结论:内皮前体细胞和平滑肌细胞以3:1～4:1共培养的模式可以促进微血管样结构的形成.     

白血病小鼠单倍型相合骨髓移植的归巢

背景:移植后造血干细胞的顺利归巢是单倍相合骨髓移植成功的关键.目的:构建小鼠白血病模型,进行单倍型相合的骨髓移植,动态观察受体小鼠体内移植细胞归巢率及不同时间点的归巢规律.设计、时间及地点:随机对照观察实验,于2005-11/2007-10在福建医科大学实验动物中心清洁级动物实验室进行.材料:供鼠为清洁级近交系C57BL/6小鼠和C57BL/6小鼠与BALB/c 小鼠杂交的雄性F1小鼠,受鼠为清洁级近交系雌性BALB/c小鼠,用于构建白血病小鼠模型.方法:将48只造模小鼠随机分为2组,对照组供鼠为C57BL/6小鼠,实验组供鼠为F1小鼠.实验组进行主要组织相容性复合物单倍型相合的同种异基因骨髓移植,对照组进行主要组织相容性复合物完全不相合的骨髓移植.主要观察指标:移植后1,2,3,4 d动态观察小鼠外周血、骨髓和脾中有核细胞计数,以流式细胞仪检测可与FITC标记的抗鼠H-2Kb单抗结合的供鼠阳性细胞并计算骨髓和脾归巢率.结果:对照组外周血中供鼠来源的细胞数持续下降,脾和骨髓的归巢率均为先升后降,提示供者来源的骨髓细胞在受鼠体内为先归巢再出巢;实验组外周血中供鼠来源的细胞数先下降,再持续上升,骨髓归巢率为下降后上升,脾归巢率为上升后下降,提示供鼠来源骨髓细胞在骨髓中表现为出巢后再归巢,脾中有延迟,与对照组比较,实验组第4天外周血中供鼠细胞数量及骨髓和脾归巢率均增高(P<0.05).结论:主要组织相容性复合物单倍体相合的骨髓移植的归巢规律是先出巢再归巢,归巢的细胞数量和归巢率高于主要组织相容性复合物完全不相合骨髓移植.