HCV5'NCR片段调控荧光素酶表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的构建ＨＣＶ５ＮＣＲ片段调控荧光素酶表达质粒,并在ＨｅｐＧ２细胞中表达。方法通过ＰＣＲ扩增,获得中国人ＨＣＶ基因组５非编码区（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ,ＮＣＲ）完整序列与Ｃ区部分序列的目的基因片段（５ＮＣＲ－Ｃ片段）。将此片段插入ｐＧＬ３荧光素酶报告载体的荧光素酶基因起始密码上游,构建受５ＮＣＲ片段调控的荧光素酶表达质粒。应用脂质体介导基因转染技术将８个质粒转染ＨｅｐＧ２肝癌细胞。结果经鉴定获得８个均为正向插入的阳性克隆。序列分析结果表明插入片段与中国人ＨＣＶ（Ⅱ型）序列基本一致,其荧光素酶基因起始密码子已去除且未改变编码框。有一个质粒能够表达荧光素酶活性,其绝对值达１１４１．９±１５１．１ｍＶ,是ｐＧＬ３报告载体荧光素酶活性的２０％。结论当质粒１μｇ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ６μｌ,Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ－质粒复合物与细胞孵育４小时时可获得最佳转染效果     

HCV 5′NCR调控抑制活性的反义寡核苷酸的筛选

目的寻找高效特异的新型抗HCV药物,探讨针对HCV基因的硫代修饰反义寡核甘酸（S-ASODNs）最佳作用靶序列。方法参考HCV5′NCR计算机预测的二级结构图,设计合成了15条S-ASODN、3条正义寡核苷酸及1条随机序列,采用HCV5′NCR调控荧光素酶基因的瞬时表达系统,将S-ASODN与pHCV-neo4共转染,通过荧光素酶活性表达高低,反映S-ASODN对HCV调控基因的抑制活性。结果5条S-ASODN即HCV65、HCV279、HCV363、HCV349及HCV352在25～100nmol/L浓度范围内,对HCV调控基因具有特异性的剂量依赖性抑制活性。当浓度为100nmol/L时,这些ASODN的抑制率可达80％以上,IC50值提示HCV363的抑制活性最强。通过阴性对照实验包括正义寡核苷酸、随机序列及不含HCV序列的靶载体pGL3提示ASODN仅存在轻度非特异性作用。此外,实验结果还提示不同作用靶位的ASODN之间具有一定的协同作用。结论HCV5′NCR第二茎环结构Ⅱa、第三茎环结构Ⅲd和翻译起始区可能是ASODN作用的重要靶序列。     

釉原蛋白基因启动子的克隆及在不同细胞中转录调控的分析

目的：克隆釉原蛋白基因启动子及可能影响转录调控的序列,分析其在不同细胞中的转录模式。方法：检索并分析釉原蛋白基因的上游调控序列．利用PCR及酶切方法,从小鼠C57BL／6J基因组上扩增不同长度（包括基本启动子区域）的转录调控序列,与PGL3-Basic载体的虫荧光素酶基因连接。瞬时转染CHO、Hela、UMR-106细胞,检测荧光素酶的活性．分析不同长度的启动子片段在各种细胞中的转录活性。结果：共构建了6个不同长度的报告载体,瞬转后发现在Hela细胞中有较强的荧光素酶活性,在CHO、UMR-106细胞中活性很弱。在不同的细胞内,启动子活性随片段长度变化,其变化趋势有明显的相似性。表现为在转录起始点上游975bp与532bp的区域具有较强的转录活性．而转录起始点上游285bp区域的转录活性有所降低。结论：釉原蛋白的启动子可在Hela细胞中激活,Hela细胞可作为研究釉原蛋白启动子转录调控的细胞模型：初步判断釉原蛋白启动子上的-1693与-975之间的序列为转录抑制区域,-532与-285之间为转录增强区域。     

毒热平注射液对甲型流感病毒H3N2体外感染细胞中TLR7信号通路的影响

目的:观察甲型流感病毒H3N2感染人胚肾上皮细胞(HEK-293T)细胞及人肺腺癌上皮细胞(A549)细胞后,对NF-κB转录活性以及TLR7、TNF-α、IL-8、IFN-βmRNA的影响,探讨H3N2对体外感染细胞中TLR7信号通路的影响及清热解毒中药毒热平注射液的干预作用。方法:采用MTT法体外检测各组药物对293T、A549细胞增殖的影响;H3N2感染293T细胞后,利用双荧光素酶报告系统,以利巴韦林、清开灵注射液为药物对照,检测毒热平注射液各浓度组细胞中NF-κB相对荧光素酶活性;H3N2感染A549细胞后,RT-PCR方法检测各组细胞中TLR7、TNF-α、IL-8、IFN-βmRNA水平。结果:MTT结果显示,毒热平、利巴韦林、清开灵注射液各浓度不影响细胞正常增殖(P>0.05)。报告基因结果显示,与细胞对照组相比,H3N2感染组细胞NF-κB转录活性显著增高(P<0.01);与H3N2感染组相比,利巴韦林0.5μg/mL,清开灵1/128稀释组,毒热平1μg/mL,10μg/mL,100μg/mL组均可不同程度下调NF-κB的转录活性(P<0.01)。RT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H...     

缺氧调控报告载体的构建与鉴定

目的:构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体. 方法:合成缺氧应答元件(HRE)的寡核苷酸序列及其突变对照,克隆入pCI-neo,构建HRE/CMV重组载体. 然后采用PCR方法将HRE/CMV启动子定向亚克隆入pGL3-Basic. 结果:酶切和测序鉴定分析,所克隆的基因产物酶切结果与预期值一致,序列无碱基的突变. 结论:成功构建了缺氧应答启动子的荧光素酶报告载体,为进一步研究其缺氧调控作用提供了条件.     

长链非编码RNA NCK1-AS1作为海绵体与TCF4竞争结合miR-153-5p调节乳腺癌细胞侵袭、炎症和凋亡

目的：研究LncRNA NCK1-AS1与miR-153-5p调节转录因子4(TCF4)对乳腺癌细胞生长、运动和炎症因子的影响。方法：以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7作为体外研究对象，将裸鼠作为体内研究对象。RT-qPCR检测组织和细胞中LncRNA NCK1-AS1、miR-153-5p和TCF4表达；TargetScan预测与双荧光素酶报告实验验证LncRNA NCK1-AS1与miR-153-5p的靶向关系；Transwell检测细胞侵袭；ELISA检测炎症因子水平；流式细胞术检测凋亡；Western blot检测TCF4、c-myc、c-jun蛋白水平；裸鼠皮下注射MDA-MB-231细胞建立移植瘤模型；免疫组化检测Caspase-3、VEGF阳性细胞百分比。结果：LncRNA NCK1及TCF4在癌组织和细胞中高表达，而miR-153-5p则低表达。与对照组比较，LncRNA NCK1-AS1干扰抑制乳腺癌细胞侵袭和炎症反应，并促进其凋亡。LncRNA NCK1-AS1与miR-153-5p存在靶向关系。与对照组相比，LncRNA NCK1-AS1干扰和miR-1...     

含人雌激素受体β基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及脂氧素对其转录活性的调节

目的:构建含人雌激素受体β(ERβ)基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并探究阿司匹林诱生的脂氧素(LXA_4)对其转录活性的影响。方法:以子宫内膜间质细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增ERβ启动子序列,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建pGL3-basic-ERβ报告基因载体,行双酶切及测序鉴定后将上述载体与pCMX-βgal载体共转染293T细胞24小时后,加入不同浓度(0.1、1、10、100 nmol/L)的LXA_4刺激24小时,然后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:测序结果表明,构建的pGL3-basic-ERβ荧光素酶报告基因载体序列正确;在293T细胞中,构建的pGL3-basic-ERβ报告基因载体与空载体pGL3-basic相比,pGL3-basic-ERβ报告基因载体的转录活性提高了将近十倍;荧光素酶报告系统表明,LXA4浓度为0.1、1、10、100 nmol/L时其相对荧光强度与对照组比较明显升高(P0.05),10 nmol/L浓度的相对荧光强度明显高于其他浓度(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-basic-ERβ荧光素酶报告基因载体,并证明在一定浓度LXA_4的刺激下ERβ启动子区域转录活性升高,LXA_4浓度为10 nmol/L时转录活性达最高值。     

利用纳米荧光素酶快速预测G蛋白偶联受体结构

本文以β2-肾上腺素能受体(beta-2 adrenergic receptor, β2-AR)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、血管紧张素Ⅱ-1型受体(angiotensin II type 1 receptor, AT1R)为例,建立可快速预测G蛋白偶联受体(G proteincoupled receptors, GPCRs) N端、C端、胞内环、胞外环、跨膜(transmembrane, TM)区氨基酸起始位置的方法,并通过此方法预测Mas相关基因G蛋白偶联受体X3 (Mas-related G protein-coupled receptors X3, MRGPRX3)的结构。具体操作为利用不依赖序列和连接的克隆方法 (sequence and ligation-independent cloning, Slic)将纳米荧光素酶(nanoluciferase, NLuc)插入GPCRs的不同位点,在同一受体表达水平相同的条件下,检测NLuc插入GPCRs不同位点对于发光值的影响。结果显示,当NLuc插入GPCRs不同位点时,检测到的NLuc发光...     

miR-320b靶基因预测与鉴定

目的 寻找miR-320b靶基因，探讨其参与T2DM发生发展的分子机制。方法 4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因。采用在线软件VENNY2.1选取4种预测结果交集。在线数据库String查询靶基因编码蛋白质间的相关性，筛选其候选靶基因。采取全基因合成方式合成野生型及突变型靶基因双荧光素酶重组Psicheck-2质粒载体，Sanger测序鉴定重组质粒是否构建成功。选取对数生长期293T细胞分为6组：野生型质粒+miRNA阴性对照组（Psicheck2-PTEN-WT+NC）和野生型质粒+miR-320b mimic组（Psicheck2-PTEN-WT+mimic）；突变型质粒+miRNA阴性对照组（Psicheck2-PTEN-Mut+NC）和突变型质粒+miR-320b mimic组（Psicheck2-PTEN-Mut+mimic）；空质粒载体+miRNA阴性对照组（Psicheck2-NC+NC）和空质粒载体+miR-320b mimic组（Psicheck2-NC+mimic）。各组进行相应质粒和miR...