小鼠β_2m反义核酸重组荧光蛋白表达载体的构建及表达研究

本研究应用分子生物学技术 ,构建小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN ,经过酶切、PCR鉴定 ,以及序列分析证实克隆的正确性。然后用脂质体转染NIH3T3细胞 ,经过RT PCR及Westernblot检测 ,观察重组质粒对细胞β2 mmRNA和蛋白表达的影响 ,同时在荧光显微镜下直接观察细胞转染的结果。结果证明pEGFP β2 mAN已成功导入NIH3T3细胞中 ,且有效表达 ,在荧光显微镜下可见梭形绿色荧光细胞 ;与同步转染的小鼠 β2 m正、反义核酸表达载体pcDNA3 β2 mSN、pcDNA3 β2 mAN的转染结果一起进行分析 ,转染pcDNA3 β2 mSN细胞的 β2 mmRNA和蛋白表达水平升高 ,而转染pcD NA3 β2 mAN和pEGFP β2 mAN的细胞 β2 mmRNA和蛋白表达水平降低。小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN的转染结果显示 :它不但可以降低NIH3T3细胞 β2 m基因的表达 ,而且为观察脂质体转染效果提供了直观、即时的方法     

转染反义磷脂酶A2寡核苷酸抑制LPS诱导Hela细胞分泌IL-1β和IL-6

目的：研究脑浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2,85—kD PLA2)在脂多糖诱导Hela细胞释放细胞因子IL-1β、IL-6的信号机制中的作用。方法：①利用脂质体将cPLA2的反义寡核苷酸转染入Hela细胞，通过聚合酶链式反应(RT—PCR)及Western杂交印迹分析检验胞浆中cPLA2人水平的变化；②用放免方法检测不同时间培养上清中的IL-1β、IL-6浓度。结果：①转染后cPLA2的蛋白表达明显减少，但mRNA水平未见显著改变；②Hela细胞释放IL-1β、IL-6随cPLA2人反义寡核苷酸浓度的增加而减少。结论：cPLA2人LPS刺激的Hela细胞释放炎性细胞因子IL-1β、IL-6的过程中可能发挥重要的信号传递作用。     

Acceleration of Immune Reconstitution after Bone Marrow Transplantation in Mice by Bone Marrow Stromal

To observe potential effect of the engineered bone marrow stromal cell line QXMSC1 secreting IL-6 (QXMSCIL-6) on accelerating immnune reconstitution in syngeneic bone marrow transplantation in mice, QXMSC1 was transfected with the eukaryocytic expression vector pcDNAIL-6, which contained hIL-6 cDNA by liposome-mediated gene transfecting technique. G418-resistance clone was selected by limiting dilution. The highest secreting clone was selected by ELISA assay and used in animal experiments. The recipient mice (BALB/c) were lethally irradiated and cotransplanted syngeneic bone marrow (10^7/mice) and the QXMSCIIL-6 (5×10^5/mice). Lymphocyte proliferation induced by ConA and LPS, helper T lymphocyte precursor (HTLp), cytotoxic T lymphocyte precursor (CTLp), plaque-forming cell (PFC), delayed type hypersensitivity (DTH) were examined 30, 60 days in post transplantation respectively. The results showed that lymphocytes proliferation to ConA and LPS, HTLp, CTLp increased, DTH and PFC were improved by cografted stromal cells QXMSCIIL-6 on 30, 60 days after BMT. These results demonstrated that the bone marrow stromal cell line QXMSC1 IL-6 transfected with IL-6 (QXMSC11L-6) accelerated immnune reconstitution in syngeneic bone marrow transplantation.     

重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究重组腺病毒介导的人胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对人肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法:将含hCGPXcDNA的质粒pGEM-T-hCG-Px和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA重组,构建pACC-MV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建重组腺病毒AdCMV-hCGPx。以重组腺病毒载体AdCMV-hCGPx转染体外培养的人肾小管上皮细胞株HK-2,以转染空载体的HK-2细胞为对照组,检测转染细胞中CGPx的表达水平。将HK-2细胞经缺氧再复氧损伤处理后,分别检测细胞的存活率、凋亡率及死亡率。结果:各转染组细胞中CGPx的表达率显著高于对照组(P<0.01)。经缺氧再复氧损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞的存活率较对照组明显增强,死亡细胞明显减少,细胞凋亡明显受到抑制。结论:重组腺病毒介导的hCGPx转染人肾小管上皮细胞可保护缺氧再复氧引起的损伤。     

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.     

CTLA4Ig基因转染猪皮治疗中小面积浅Ⅱ度烧伤创面的随机对照试验

目的探讨CTLA4Ig基因转染猪皮治疗中小面积浅Ⅱ度烧伤创面的临床疗效与安全性。方法将自2005年5月～2007年5月我院收治的浅Ⅱ度烧伤患者60例随机分为2组，每组30例。基因转染猪皮治疗组：伤后创面简单清创，去除水疱，用复温后的基因转染猪皮覆盖创面。对照组：创面简单清创，除颜面、会阴部位创面外，均予包扎治疗，保留水疱皮，其后常规换药治疗。结果基因转染猪皮治疗组创面愈合时间5～10d，对照组为8～14d。基因转染猪皮治疗组疼痛明显减轻，未观察到寒战、高热等全身不良反应及局部排斥反应。两组均未出现瘢痕，但对照组部分病例出现色素改变。结论应用基因转染猪皮治疗中小面积浅Ⅱ度烧伤创面能明显缩短创面愈合时间，能明显减轻创面疼痛，减少换药次数，预防色素改变及瘢痕形成。     

聚乙烯亚胺用作基因转染的研究进展

 基因载体问题以及与载体相关的免疫反应、细胞毒性和安全性等问题，是基因治疗领域亟待解决的关键问题之一。聚乙烯亚胺（PEI）是阳离子聚合物非病毒载体的典型代表^[1]，是一种很早便为人所知并予以应用的有机大分子。目前，以 PEI 阳离子聚合物与 DNA 形成的 PEI/DNA 复合物已成为非病毒基因载体的研究热点。本文就近年来这方面的研究进展作简要综述。 1 PEI的特性 PEI 每 3 个原子中有 1 个胺基原子，使其具有较高正电荷密度。根据 pH 与质子作用之间的对应关系可得出：自由 PEI 的结构在生理条件下有 1/6 至 1/5 胺基发生质子化反应，从而使溶酶体肿胀破裂，从而起到“质子海绵”作用，使 PEI/DNA 复合物得以释放入胞质，很大程度上减少了 DNA 在吞噬泡内富集并进而被降解的作用，因而可以提高转染效率^[2]。     

转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长和化疗敏感性的影响

目的 研究转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长的影响以及转染后淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性。方法 构建survivin反义mRNA真核表达质粒pcDNA3．1-反义（As）survivin;利用脂质体转染法将其转入高表达survivin mRNA T淋巴母细胞淋巴瘤Jurkat细胞系,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫组织化学SP法、Western印迹法检测细胞中survivin表达;用细胞计数、流式细胞术（FCM）检测其细胞生长曲线、细胞凋亡指数,并进行光镜、电镜形态学观察;并对转染pcDNA3．1-Assurvivin前后Jurkat细胞分别加入4-羟基-环磷酰胺（CTX）、甲氨蝶呤（MTX）72h后,常规MTT检测细胞存活率。结果 RT—PCR检测转染pcDNA3．1-Assurvivin后48h、5和6周Jurkat细胞survivin mRNA表达,发现survivin mRNA表达皆低于对照组;转染后survivin蛋白表达也明显降低。转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞生长倍增时间（52h）明显延长;用FCM检测细胞凋亡发现,转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞凋亡指数[20．2％（48h）]明显高于对照组（转染空质粒和未转染组,2．1％和1．3％）;5和6周为6．2％和6．8％,明显高于未转染细胞（1．3％和1．0％）。光镜、电镜观察见转染细胞出现较多凋亡细胞及一些变性肿胀细胞;MTT检测结果显示Jurkat细胞转染前后,经化疗药物4-羟基-环磷酰胺和甲氨蝶呤作用,转染细胞的抑制率明显大于未转染组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 survivin基因对Jurkat细胞系的生长起着重要的作用,抑制survivin基因表达在T淋巴母细胞淋巴瘤治疗中可能有重要的意义,该基因似可能作为治疗的靶点。     

AU14－1单克隆抗体与宫颈癌免疫学研究

本文概述了抗宫颈癌单克隆抗体ＡＵ１４－１的制备技术，杂交瘤和转染体细胞的无血清长期培养；抗体及其交联物的杭瘤作用和逃逸机制；宫颈癌抗原的免疫组化和血清学分析；人和小鼠宫颈癌的共同抗原决定簇和“进化抗原”。     

细胞周期蛋白E对乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响

观察细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）Ｅ的表达对乳腺癌细胞ＭＣＦ－７生长及其他周期相关基因的影响。方法构建正义和反义ｃｙｃｌｉｎ Ｅ ｃＤＮＡ真核表达载体,并采用ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ转染,将其导入ＭＣＦ－７细胞,获得稳定表达正义及反义ｃｙｃｌｉｎＥ的细胞系,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测有外源性片片段的插入及表达,并作细胞生长曲线、四甲偶氮唑盐（ＭＴＴ）法和流式细胞计数分析;用