一种核酸适配体高敏检测方法的建立及应用评价

本文建立一种基于免疫印迹的核酸适配体高敏定量分析的检测方法,并探讨其在适配体药物靶向性研究中的应用价值。首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行核酸适配体的分离,然后利用电转的方法将凝胶上的核酸适配体转移至PVDF膜上,先后孵育Rabbit Anti-Biotin和HRP-Streptavidin抗体,最后利用化学发光仪进行成像。结果显示核酸适配体可以通过该方法进行定量检测分析,且该方法检测灵敏度高,能够识别荧光染料法检测不到的浓度范围。此外,该方法只识别被生物素修饰的核酸适配体,特异性强。结果提示,核酸免疫印记法可以作为核酸适配体药物靶向性研究的一个定量检测手段。     

黄芪水提物抑制PI3K/Akt通路预防肺癌发生的作用及机制研究

目的探讨黄芪水提物对肺癌的抑制作用及相关机制。方法采用MTT实验、Ed U实验以及划痕实验检测黄芪水提物对肺癌A549和H1299细胞的活性、增殖能力和迁移能力的影响,采用流式细胞仪考察黄芪水提物对肺癌细胞周期的影响,通过Western blotting实验检测PI3K/Akt通路相关蛋白表达,通过苯并芘诱导的小鼠肺癌模型观察黄芪水提物对体内肺癌的影响。结果 MTT实验结果表明,黄芪水提物作用于A549和H1299细胞48 h后,细胞的生长活性被抑制;Ed U实验结果表明,黄芪水提物能够显著抑制A549和H1299细胞的增殖能力;对细胞周期考察的实验结果表明,黄芪水提物能够将A549和H1299细胞周期阻滞在S期;划痕实验结果表明,黄芪水提物作用于A549和H1299细胞24 h和48 h后,能够显著抑制细胞的迁移能力;Western blotting实验结果表明,黄芪水提物能够下调A549和H1299细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(p-PDK1)和磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平;体内实验结果表明,黄芪水提物能够显著抑制小鼠肺部肿瘤数量及大小。结论黄芪水提物能够抑制肺癌,该机制可能与PI3K/Akt信号通路受阻有关。     

附子药代动力学研究进展

附子为毛茛科多年生草本植物乌头子根的加工品,具有局麻、镇痛、镇静、强心、抗炎、抗肿瘤等功效,广泛用于治疗跌打损伤,风湿关节炎,肿瘤等疾病。由于在临床使用过程中不良反应和中毒事件频频发生,近年来对附子提取物及其有效/有毒成分的药代动力学研究甚多,作者对此研究近况做一综述。     

流式细胞术测定巴戟天基因组大小

目的估测广东省地道药材巴戟天(Morinda officinalis How)的基因组大小,为巴戟天基因组、种质资源评价等研究提供参考。方法选取番茄为内标植物,巴戟天嫩叶为实验材料。采用OTTO两步法制备细胞核悬液,用碘化丙啶(PI)进行细胞核染色,使用流式细胞仪测定番茄和巴戟天细胞核的荧光强度,计算巴戟天基因组大小。结果 OTTO两步法适合用于制备番茄和巴戟天核悬液,在流式细胞仪中成功检测到二倍体和四倍体的粒子团,流式细胞仪测定番茄细胞核平均荧光峰值为30 481,巴戟天细胞核平均荧光强度值为15 278,计算出巴戟天的基因组大小约为(451.11±37.16)Mbp。结论实验估测了巴戟天基因组的大小,所摸索的OTTO两步法可为其他药用植物提供借鉴。     

鸢尾糖基转移酶ItUGT797基因的克隆与表达分析＊

目的 对川射干（Iris tectorum Maxim.）中可能参与黄酮类化合物生物合成的糖基转移酶基因ItUGT797展开初步研究，解析ItUGT797编码蛋白的各项生物信息指标并优化其原核表达体系。方法 提取鸢尾各组织部位的RNA并进行反转录获得cDNA文库，根据鸢尾转录组中ItUGT797基因序列设计基因特异性引物，通过同源克隆的方法构建pET-32a （+）-ItUGT797原核表达重组载体。使用各类生物信息学网站对测序后的ItUGT797序列进行理化性质、蛋白结构和进化关系等分析；实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）验证基因在各部位的表达情况；蛋白体外表达情况则使用大肠杆菌体系检测。结果 ItUGT797开放阅读框长度为1455 bp，编码蛋白分子量大小分别为53.80 kDa。ItUGT797在各组织中表达情况为花>叶>根茎。系统发育进化树表明，ItUGT797可能是具有7-O-糖基化活性的糖基转移酶。原核表达结果显示在诱导剂IPTG为0.1mM时，ItUGT797能够表达出较多的可溶性蛋白。结论 本研究成功从鸢尾中克隆了ItUGT797基因，并分析了其编码蛋白的特征，检测了基因在根茎、叶和花中的表达量，同时通过原核表达体系筛选出最适合该基因可溶性蛋白表达的诱导剂浓度，为后续探索其参与鸢尾中黄酮类成分生物合成的功能奠定理论基础。     

四逆散含药血清对皮质酮损伤PC12细胞钙敏感受体相关作用机制研究北大核心CSCD

目的探讨四逆散对皮质酮诱导PC12细胞损伤的干预作用是否与钙敏感受体(CaSR)以及细胞凋亡密切相关。方法以四逆散含药血清为干预药物,将PC12细胞分为空白血清组、皮质酮组、2.5%、5%、10%含药血清组,MTT法检测细胞存活率。通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法、蛋白免疫印迹技术对细胞凋亡率以及C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)、细胞Cytochrome C蛋白进行检测。通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法检测四逆散含药血清联合CaSR激动剂(GdCl3)或CaSR抑制剂(NPS2390)各组细胞的凋亡率。结果与空白血清组比较,皮质酮组存活率、CaSR蛋白表达量降低(P<0.01,P<0.05);皮质酮组凋亡率、C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)以及胞浆Cytochrome C蛋白表达量增加(P<0.01,P<0.05)。与皮质酮组比较,含药血清组存活率增加(P<0.01),5%、10%含药血清组CaSR蛋白表达量及皮质酮+NPS2390组凋亡率增加(P<0.01,P<0.05);含药血清组、皮质酮+GdCl3组凋亡率降低(P<0.01)和10%含药血清组C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)、胞浆Cytochrome C蛋白表达量降低(P<0.01)。与皮质酮+10%含药血清组比较,皮质酮+10%含药血清+NPS2390组凋亡率增加(P<0.01)。与皮质酮+GdCl3组比较,皮质酮+10%含药血清+GdCl3组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论四逆散含药血清可以抑制皮质酮诱导的PC12细胞凋亡,其作用机制与CaSR有关。     

ATRNL1在阿尔茨海默病中的基因功能分析及ceRNA网络预测

目的：通过对ATRNL1基因的生物信息学分析,明确其在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）中的作用。方法：通过高通量基因表达（gene expression omnibus,GEO）数据库下载AD芯片数据GSE36980、GSE1297和GSE28146,利用3个独立数据验证ATRNL1在AD中的差异表达情况,并计算Pearson相关系数分析ATRNL1与临床信息的相关性;使用GSE1297数据筛选ATRNL1共表达基因并使用clusterProfiler程序包进行基因功能注释,包括基因本体论（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析;为研究ATRNL1差异表达的调控机制,使用multiMiR程序包下载miRNA相互作用数据,根据竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)的调控机制构建ATRNL1-miRNA-mRNA调控网络。结果：3个独立芯片数据中ATRNL1在AD中表达明显下降（P<0.05）...     

白花蛇舌草和水线草的鉴别与药用进展比较

白花蛇舌草Hedyotis diffusa与水线草H.corymbosa同为茜草科(Rubiaceae)耳草属Hedyotis Linn.植物,均具有清热解毒功效,且有一定的抗肿瘤活性,故水线草常作为白花蛇舌草的替代品使用,目前关于二者替代使用的可行性和合理性尚无定论。鉴于此,从本草考证、药用沿革、混用情况、商品状况、性状及显微特征、化学成分、药理活性等方面对二者进行系统比较,发现二者性状、显微特征较为相似,但成分、活性等方面存在较为明显的差异,可以通过分子鉴定方法对二者进行快速鉴别,故建议二者在使用上应予以区别。     

流式细胞仪测定三种鸢尾科植物基因组的大小

目的:研究传统药用植物射干和鸢尾的基因组大小,为射干属和鸢尾属药用植物种质资源、品种鉴定和基因组研究提供参考。方法:本研究采用OTTO两步法制备细胞核悬液,使用碘化丙啶(PI)染色,以番茄作为内标植物,用流式细胞仪分别测定鸢尾、射干和巴西鸢尾新鲜叶片核悬液的荧光吸收强度,估算它们的基因组大小。结果:射干的基因组大小约为(5 296.27±177.06)Mbp,鸢尾基因组大小约为(4 494.07±76.57)Mbp,巴西鸢尾的基因组大小约为(4 074.91±170.70)Mbp。结论:3种鸢尾科药用植物的基因组较为复杂,射干和鸢尾、巴西鸢尾基因组间差异较大,鸢尾和巴西鸢尾的基因组差异较小。     

外排转运蛋白对异莨菪亭体内处置的调控机制研究

目的采用外排转运蛋白基因敲除小鼠模型,探讨乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein,BCRP)和多药耐药相关蛋白2(multidrugresistance-associatedprotein2,MRP2)对异莨菪亭及其代谢物异莨菪亭-6-O-β-葡萄糖醛酸苷(isoscopoletin-6-O-β-glucuronide,I-6-G)体内处置的影响及调控机制。方法野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠分别ig异莨菪亭(2 mg/kg)或尾iv异莨菪亭(1 mg/kg),采用超高效液相色谱与质谱联用(UHPLCMS/MS)法测定小鼠血浆中异莨菪亭及I-6-G的浓度,分析外排转运蛋白BCRP和MRP2对异莨菪亭及I-6-G药动学特征的影响;采用小鼠在体肠灌流模型研究BCRP和MRP2对异莨菪亭及I-6-G肠道处置的调控作用;采用小鼠肝微粒体和小肠微粒体考察异莨菪亭在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠体内的葡萄糖醛酸化代谢特征。结果异莨菪亭在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠体内的生物利用度分别为7.85%、3.54%、5.76%、10.27%。ig异莨菪亭后,与野生型FVB小鼠相比,Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠体内异莨菪亭的药-时曲线下面积(AUC0～t)分别增加了2.8、5.6倍(P0.01、0.001),Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠体内I-6-G的AUC0～t分别增加了0.6、1.0、8.2倍(P0.05、0.001)。尾iv异莨菪亭后,与野生型FVB小鼠相比,Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠体内异莨菪亭的AUC0～t分别增加了4.0、3.8倍(P0.05、0.01),Bcrp1-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠体内I-6-G的AUC0～t分别增加了2.1、9.1倍(P0.01)。与野生型FVB小鼠相比,Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠体内I-6-G外排入十二指肠肠腔和胆汁中的量均减少了55.7%～90.1%(P0.05、0.01)。外排转运蛋白BCRP和MRP2缺失后,对小鼠肝微粒体和小肠微粒体中异莨菪亭葡萄糖醛酸化代谢物I-6-G的清除率影响较小。结论外排转运蛋白BCRP和MRP2参与调控异莨菪亭及其代谢物I-6-G的体内处置。