Toll样受体在过敏性疾病、感染性疾病及肿瘤中的研究进展

先天性免疫是机体抵御病原体入侵和维持自体稳态的一个重要防御机制。Toll样受体作为先天性免疫机制中的重要受体分子,被认为在多个免疫反应相关的信号通路中起关键作用。Toll样受体家族成员能识别病原信号分子,激活机体免疫系统。然而,在不同疾病中,Toll样受体的激活或抑制将发挥截然不同的作用。本文重点阐述了Toll样受体在过敏性疾病、感染性疾病和肿瘤中的研究进展,并讨论了Toll样受体及相关药物在这些疾病中的应用。     

BMPR-Ⅱ基因mRNA荧光定量PCR检测标准品的构建

目的构建检测BMPR-Ⅱ基因mRNA表达水平差异的标准品。方法以人胚肺成纤维细胞的总RNA为模板、O ligo(dT)18为引物逆转录产生cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人BMPR-Ⅱ基因相应的cDNA片断,构建pMD-18-BMPR-Ⅱ重组质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果成功克隆了人BMPR-ⅡcDNA,并以其为标准制作出荧光定量PCR标准曲线。结论成功构建了BMPR-Ⅱ基因荧光定量PCR标准质粒,为今后BMPR-ⅡmRNA的荧光定量PCR检测打下了基础。     

六耳铃化学成分研究

目的:研究六耳铃的化学成分.方法:采用柱色谱技术,分离六耳铃醇提物的乙酸乙酯萃取部位的化学成分;根据光谱分析和文献对照的方法鉴定分离所得化合物的结构.结果:分离并鉴定了5个化合物,分别为原儿茶酸(1)、香叶木素(2)、芹菜素(3)、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸(4)、东莨菪素(5).结论:化合物1～5均为首次从该植物中分离得到,亦首次从艾纳香属植物中分离得到.     

喜树碱诱导的HL-60细胞凋亡过程中线粒体的变化

目的:研究喜树碱(CPT)诱导的人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60凋亡过程中线粒体的质量和膜电势的变化。方法:以CPT诱导HL-60细胞凋亡为模型,利用膜联蛋白V(annexinV)-FITC/PI双染流式细胞术,研究HL-60细胞的凋亡和坏死。用DiOC6(3)染色流式细胞术,检测线粒体的膜电势(△ψm)。用NAO染色流式细胞术,检测线粒体的质量。结果:在4×10-6mol/LCPT的诱导下,HL-60细胞(12h)早期的凋亡率为(12.75±4.61)%,对照组为(2.88±2.49)%,二者相比较差异显著(P<0.01);CPT组坏死比率为(3.48±1.67)%,对照组为(0.71±1.10)%(P<0.01)。PI染色的结果显示,HL-60细胞(12h)晚期凋亡细胞的百分率,CPT组为(3.52±1.07)%,对照组为(0.46±1.06)%(P<0.01)。同时观察到,G2/M期细胞出现阻滞,G2/M期细胞的百分率,对照组为(22.46±2.19)%,CPT组为(13.45±1.91)%(P<0.01)。在12h时间点,CPT组线粒体的质量显著低于对照组(P<0.01),低线粒体质量的细胞所占百分率,对照组为(4.53±1.26)%,CPT组为(25.74±2.09)%。同时,CPT组线粒体的膜电势显著下降(P<0.01),CPT组线粒体膜电势降低的比率为(17.71±5.23)%,对照组为(1.64±2.00)%。结论:CPT诱导HL-60细胞凋亡过程中,线粒体的质量和膜电势均有所下降,但其去极化作用增强。     

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的：纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体，建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法：以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB／c小鼠，经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水，经辛酸沉淀纯化后，制备亲和层析柱。纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体。结果：用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAg Fab的纯度可达95％以上，回收率可达70％～85％。结论：人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质，可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab，适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab。     

IL-22和IL-17 mRNA在慢性HBV感染者PBMCs中的表达及其意义

目的:探讨慢性HBV感染者外周血单个核细胞IL-22和IL-17 mRNA表达及其对病情转归的影响.方法:以慢性乙型肝炎中度患者33例、重度患者21例、重型肝炎患者16例、乙型肝炎肝硬化患者16例和健康对照10例为研究对象,采用RT-PCR方法检测患者外周血单个核细胞IL-22和IL-17 mRNA的表达.结果:CHB中度、CHB重度和肝硬化患者IL-22表达水平无统计学意义,但均高于健康对照组,差异有统计学意义(P=0.000);而重型肝炎患者IL-22表达水平低于该3组患者,高于健康对照组,但差异无统计学意义(P=0.064).各组IL-17表达水平相似但均高于健康对照组,差异有统计学意义(P=0.000);重型肝炎患者IL-17表达水平均低于其他3组患者,与CHB中度患者比较差异有统计学意义(P=0.014),与CHB重度和肝硬化患者比较差异无统计学意义(P=0.172,0.968).结论:IL-22的下调不利于肝细胞损伤后的修复,IL-22分泌的增加对减轻肝组织的损伤特别是重型肝炎的恢复可能是有意义的.慢性HBV感染患者IL-17均明显升高,提示其可能参与慢性HBV感染肝组织炎症的发生,且对慢性肝病纤维化起一定作用.     

沉默Nanog联合SNX-2112对人食管癌干细胞样细胞的抑制作用

目的:通过沉默Nanog探讨其对Hsp90抑制剂SNX-2112诱导食管癌干细胞样细胞的裸鼠移植瘤抑制效果。方法:CCK-8分析细胞受到药物作用活性，Ki-67检测细胞增殖情况，Western blotting检测凋亡蛋白Bcl2、Bax、Bcl-xL表达情况。建立BALB/c裸鼠移植瘤模型，裸鼠分为四组，包括DMSO组、shNanog组、SNX-2112组、shNanog与SNX-2112联合用药组，每组3只。隔天给药，总共给药7次，脱颈处死小鼠，测量小鼠体重，瘤组织经HE染色，免疫组化分析Caspase3的表达情况与Hsp90客户蛋白pErk表达情况。结果:联合用药组细胞活性显著受到抑制（P<0.05），Ki-67实验显示联合用药组细胞增殖受到抑制（P<0.05），Bcl2与Bcl-xL蛋白表达下调（P<0.05），Bax表达水平上调（P<0.05）。联合用药组小鼠瘤重明显低于SNX-2112组以及shNanog组（P<0.05），HE染色结果显示沉默Nanog与SNX-2112联合用药显著性诱导肿瘤细胞凋亡，免疫组化研究显示Caspase3在两者联合用药组表达水平较高（P<0.05），Hsp90客户蛋白pErk表达有下调的趋势（P<0.05）。结论:沉默Nanog有助于提高SNX-2112诱导食管癌干细胞样细胞的裸鼠移植瘤细胞凋亡作用。     

纳米金抑制血管内皮细胞增殖的分子机制

目的 观察纳米金能否抑制血管内皮细胞增殖,以及作用的分子机制.方法 在96孔板内,无血清培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)24 h,分别加入预先孵育过夜的纳米金(1000 nmol/L)+血管内皮生长因子(VEGF)165(10μg/L)、VEGF165各100μl,噻唑蓝(MTT)比色法观察纳米金对HUVEC增殖的影响.取3种浓度(250、500、1000 nmol/L)纳米金各0.5 ml,分别与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,10 mg/L)0.5 ml,4℃孵育24 h;再加入过饱和浓度的肝素-琼脂糖凝胶,离心后用bFGF抗体检测上清液和沉淀物中bFGF含量变化.无血清培养HUVEC 5孔,每孔加入VEGF165(10μg/L)100μl;再加入不同浓度纳米金(125、250、500 nmol/L),100μl,作用5 min,用Western blot方法测定磷酸化PLC-γ1蛋白.用AFM(原子力显微镜)表征纳米金与VEGF165作用后粒径大小.结果 纳米金+VEGF165组与VEGF165组的增殖倍数分别为1.75和4.25,表明纳米金抑制HUVEC的增殖(t=14.421,P<0.01).纳米金能够与具有肝素结合位点的bFGF结合.VEGF165浓度不变(10μg/L),随着纳米金溶液浓度的增加,从125、250到500 nmol/L,纳米金抑制PLC-γ1磷酸化越来越明显.AFM观察到纳米金与VEGF165作用后,粒径普遍大于30 nm.结论 纳米金与具有肝素结合位点的VEGF165结合,抑制了VEGF165的信号传导,从而抑制血管内皮细胞增殖.     

正常细胞如何人工诱变成癌细胞

正常细胞转化成癌细胞的分子机制一直是肿瘤学研究的热点。但通过特定条件在体外培养基中转化正常人类细胞极难成功。最近在这方面的研究取得了突破性进展，成功地实现了特定条件下（即利用特定基因或其产物）将人工培养的人类正常细胞转化成癌细胞，本文将简要介绍这种转化过程及其分子肿瘤学基础。     

Disulfiram联合Cu通过上调TNF-α表达及蓄积ROS诱导白血病干细胞凋亡

目的 探讨Disulfiram联合Cu(DS/Cu)诱导急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)细胞凋亡及其相关分子机制.方法 磁珠筛选CD34+ CD38-的KG1 α细胞作为AML干细胞,流式细胞术检测空白对照组、DS单药组(5μmol/L)、DS/Cu组(5μmol/L/0.5μmol/L)、DS/Cu+NAC组(5μmol/L/0.5 μmol/L/10 mmol/L)的AML干细胞24 h后凋亡比率及ROS水平;qRT-PCR检测上述各组TNF-α、CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK凋亡相关基因mRNA表达水平;Western blot检测各组处理后TNF-α的蛋白表达水平;予以中和抗体TNF-α mAb(2μg/mL)和对照抗体IgG(2 μg/mL)预处理2h后,流式细胞术检测空白对照组、DS/Cu组、TNF-α mAb组、TNF-α mAb+DS/Cu组、IgG组及IgG+ DS/Cu组的AML干细胞24 h后的ROS水平.结果 予以DS或DS/Cu处理CD34+ CD38-KG1α细胞后,细胞凋亡率由空白对照组的(6.65±0.64)％分别上升至(11.87±1.30)％、(27.43±1.65)％,差异均具有显著性统计学意义(P =0.01和P＜0.01);CD34+ CD38-KG1 α细胞ROS也分别上升了(1.39±0.12)倍和(2.81±0.11)倍,差异也具有统计学意义(P＜0.03和P＜0.01),并且DS/Cu组比DS组更明显(P=0.00);应用NAC抑制DS/Cu诱导ROS蓄积后,细胞凋亡率由(27.43±1.65)％下降到(12.37±0.85)％(P＜0.01).qRT-PCR结果显示DS及DS/Cu均上调TNF-α、CD40、TNFRSF1B、TNFRSF11B、HRK凋亡相关基因的mRNA水平(P＜0.05),且DS/Cu组较DS组上调的更明显(P＜0.05),但是予以NAC预处理2h后,仅TNF-α基因水平依然高表达(P=0.73),而CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK基因水平均明显下调(P＜0.05).为进一步证实TNF-α作用,分别予以TNF-α mAb(2 μg/mL)或IgG(2μg/mL)预处理2h后,TNF-α mAb+DS/Cu组相比DS/Cu组的ROS相对变化率由(2.78±0.25)倍下降到(1.28±0.17)倍(P=0.00),而IgG+ DS/Cu组相比DS/Cu组的ROS相对变化率无显著性差异(P=0.23),TNF-α mAb及IgG组相比空白对照组的ROS水平无显著性差异(P=0.09和P=0.50).结论 DS/Cu可通过上调TNF-α表达及蓄积ROS诱导AML干细胞凋亡.