二烯丙基二硫上调miR-22通过Wnt-1通路抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭

目的探讨二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)上调miR-22是否通过Wnt-1通路抑制人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭。方法 MTT、细胞划痕实验、侵袭实验分别检测DADS与miR-22对MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响。在线预测软件寻找miR-22调控的靶基因,荧光素酶报告基因检测miR-22对Wnt-1 3'UTR荧光酶活性的影响。qRT-PCR检测Wnt-1mRNA表达变化。Western blot检测Wnt-1、β-catenin与TCF-4蛋白表达。结果MTT显示,DADS与miR-22可明显抑制MGC803细胞增殖(P<0.05)。划痕实验显示,DADS与miR-22可明显抑制MGC803细胞迁移,而miR-22+DADS更为明显(P<0.05)。侵袭实验显示,miR-22可抑制人胃癌MGC803细胞侵袭,而miR-22+DADS更为明显(P<0.05)。在线预测软件寻找miR-22调控的靶基因显示,Wnt-1可能是miR-22的靶基因,荧光素报告基因检测证实Wnt-1是miR-22直接调控的靶基因;qRT-PCR显示,DADS与miR-22能下调Wnt-1 mRNA表达,而miR-22+DADS更为明显(P<0.05)。Western blot显示,DADS与miR-22能下调Wnt-1、β-catenin与TCF-4蛋白表达,而miR-22+DADS尤为明显(P<0.05)。结论 DADS可上调miR-22通过Wnt-1通路明显抑制MGC803细胞增殖与迁移侵袭。     

二烯丙基二硫诱导恶性胶质瘤U251细胞凋亡的作用及机制北大核心CSCD

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人恶性胶质瘤U251细胞凋亡的作用及其分子机制。方法光学显微镜观察DADS作用后U251细胞凋亡形态学改变;流式细胞术检测DADS对U251细胞凋亡率的影响;Western blot和免疫细胞化学分别检测凋亡相关蛋白的表达。结果光学显微镜下,DADS处理U251细胞后,细胞呈现凋亡形态改变。MTT法显示,15、30、45、60 mg/L DADS处理U251细胞48 h后,生长抑制率分别为22.01%、38.82%、49.23%、55.27%,与未处理组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术显示,15、30、45 mg/L DADS处理后,细胞凋亡率分别为(5.36±0.87)%、(28.36±3.15)%和(44.58±3.95)%,显著高于对照组(2.14±0.45)%(P<0.05)。免疫细胞化学显示,45 mg/L DADS处理48 h后,Bcl-2表达平均吸光度值(0.34±0.03)较未处理细胞(0.75±0.06)明显下降(P<0.05);Bax表达平均吸光度值(0.63±0.04)高于未处理组(0.26±0.03)(P<0.05);Caspase 3表达平均吸光度值(0.41±0.05)明显高于未处理组(0.19±0.02)(P<0.05)。Western blot检测显示,15、30与45mg/L DADS处理48 h后,Bcl-2蛋白灰度值比分别为(1.21±0.18)、(0.89±0.14)与(0.41±0.09),较未处理组(2.24±0.26)显著降低(P<0.05);Bax和Caspase 3蛋白分别为(1.12±0.19)、(1.54±0.22)与(2.08±0.27)和(0.72±0.15)、(1.39±0.21)与(2.28±0.29),明显高于未处理组(0.33±0.08)和(0.14±0.06)(P<0.05)。结论 DADS可诱导恶性胶质瘤U251细胞凋亡,机制与下调Bcl-2,上调Bax、Caspase 3有关。     

Chk1/2转基因MGC803细胞系的建立与鉴定

目的构建Chk1/2基因的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌MGC803细胞,为研究Chk1/2功能奠定基础。方法参照野生型Chk1/2基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序法对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入MGC803细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果菌液特异性PCR结果表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,测序分别证实为Chk1和Chk2基因,经NCBIBLAST分析与Genbank中Chk1基因的同源性为100%,编码的氨基酸同源性为100%,Chk2基因的同源性为99%,编码的氨基酸同源性为100%。G418筛选转染细胞4周后获得稳定转染空载体pcD-NA3.1(+)的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的MGC803细胞。经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在MGC803细胞中的表达比对照组明显增加。结论成功构建Chk1/2基因真核表达载体与Chk1/2高表达MGC803细胞,为研究二烯丙基二硫诱导MGC803细胞G2/M期阻滞的机制奠定了基础。     

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G_2/M期检查点Chk1与Chk2的影响

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞G2/M期检查点Chk1与Chk2的影响。方法流式细胞术检测细胞周期改变;Northern blot、Westernblot与免疫细胞化学检测DADS处理MGC803细胞的Chk1与Chk2表达。结果流式细胞术分析显示,30 mg.L-1DADS呈时间依赖性阻滞MGC803细胞在G2/M期(P<0.05);Northern blot检测表明,DADS不同时间作用MGC803细胞后,Chk1与Chk2 mRNA表达与未处理组差异无显著性(P>0.05);免疫细胞化学发现Chk1与Chk2表达与未处理组无明显改变(P>0.05);Western blot DADS在不同时间对MGC803细胞Chk1与Chk2总蛋白表达无改变(P>0.05),而磷酸化的Chk1表达呈时间依赖性增加(P<0.05),但磷酸化的Chk2无明显改变(P>0.05)。结论 DADS阻滞MGC803细胞G2/M期与磷酸化Chk1有关。     

组织芯片分析PRSS2蛋白在胃癌组织中的表达与意义

目的 采用组织芯片分析PRSS2蛋白在胃癌组织中表达与意义,为获取胃癌诊断相关的蛋白分子提供实验资料。 方法 首先收集8例胃癌手术切除标本,包括正常胃粘膜、癌旁组织与胃癌组织,选用Western-blotting方法检测PRSS2蛋白在正常胃粘膜、癌旁组织与胃癌组织中的表达;其次运用免疫组织化学染色方法观察组织芯片（包括正常胃粘膜、癌旁和胃癌组织）中PRSS2蛋白在胃癌组织中的表达,分析其临床意义。 结果 胃癌组织中PRSS2蛋白表达较正常胃粘膜和癌旁组织明显升高,癌旁组织中的表达较正常胃粘膜组织升高;正常胃粘膜、癌旁和胃癌组织中PRSS2蛋白的阳性表达率分别为14.29%（5/34）、26.92%（7/26）和77.78%（63/81）,在胃癌组织中高分化、中分化和低分化腺癌的阳性表达率分别为60.00%（3/5）、70.59%（12/17）和81.36%（48/59）;PRSS2蛋白的阳性表达与胃癌组织的分化程度也呈现负相关。 结论 PRSS2蛋白在胃癌组织中表达较正常胃粘膜和癌旁组织高,癌旁组织中的表达较正常胃粘膜组织高,该蛋白表达与胃癌组织的发生和分化程度有关。     

组织芯片检测磷酸化AKT蛋白在不同胃组织中的表达

目的探讨磷酸化AKT蛋白在不同胃组织中的表达意义。方法采用免疫组织化学染色,检测胃组织芯片（包括对照组正常胃黏膜、癌旁、非典型增生、原发癌及淋巴结转移癌组织）中磷酸化AKT蛋白表达。结果与正常胃黏膜、癌旁和非典型增生组织相比,AKT蛋白磷酸化在原发癌、淋巴结转移癌中表达升高（P〈0．01）;与正常胃黏膜组织比较,磷酸化AKT蛋白在非典型增生组织中表达上调（P=0．26）。结论磷酸化AKT蛋白表达与胃癌的发生发展有关。