EB病毒潜伏性膜蛋白1转化NP69细胞的蛋白表达分析

目的探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1（LMP1）转化鼻咽上皮细胞NP69的表达蛋白。方法采用比较蛋白质组学方法,鉴定NP69-pLNSX与NP69-LMP1细胞系中的差异表达蛋白,分析LMP1在NP69细胞中参与调节的蛋白。结果鉴定了LMP1在NP69细胞中参与调节有22个蛋白（表达上调的蛋白9个,下调的13个）。结论LMP1在NP69细胞中可能通过调节Vimentin和Keratin 19等蛋白的表达而起转化作用。     

DADS下调肌动蛋白解聚因子抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭

  目的  研究二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）对人结肠癌SW480细胞肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor, ADF）表达及肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响。  方法  MTT、划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对SW480细胞增殖、迁移与侵袭的影响; RT-PCR、Western blot检测DADS对SW480细胞destrin与cofilin1表达的作用。  结果  MTT分析显示, 不同浓度DADS处理SW480细胞24、48、72、96 h后, 可呈时间-剂量依赖性抑制SW480细胞增殖（P < 0.05）。划痕愈合实验显示, 20、30、40、50 mg/L DADS处理48h后, 细胞迁移率分别为55.51%、34.72%、23.23%、12.87%, 较对照组75.86%与DMSO组72.58%明显降低（P < 0.05）, 表明DADS呈浓度依赖性抑制SW480细胞迁移。Transwell侵袭显示, 20、30、40、50 mg/L DADS作用24 h后, 穿膜细胞数呈剂量依赖性分别减少34.67%、50.54%、57.12%、64.59%（P < 0.05）。45mg/L DADS处理SW480细胞24、48 h后, destrin mRNA下调24.7%、60.1%, 蛋白下调30.1%、58.9%（P < 0.05）, 而处理前后cofilin1 mRNA与蛋白表达无显著性差异（P>0.05）。但SW480细胞处理1、15、30、60 min后, p-cofilin1表达呈时间依赖性分别下调18.9%、53.8%、62.1%、78.2%（P < 0.05）。  结论  DADS抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭可能与下调destrin和p-cofilin1有关。      

喉癌相关基因的生物信息学分析及真核表达载体的构建

喉癌相关基因(LCRG1)是喉癌候选抑瘤基因,目前能用于临床病理标本免疫组化的单克隆抗体依然甚少。本研究通过生物信息学分析喉癌相关基因蛋白的二级结构及抗原表位,得出最有可能的抗原表位区域为9-22,41-52,91-100,103-110,125-134,145-148,151-163,166-177,187-192,209-225,235-242,251-259,273-282等13个区域。利用PCR扩增喉癌相关基因,获得867 bp,将该片段插入真核载体V152H中,构建真核表达质粒V152H-LCRG1。再将该质粒转染到人胚肾HEK293细胞,经SDS-PAGE证实成功表达后用Ni2＋2NTA柱层析纯化,得到纯度＞95%的蛋白,为筛选单克隆抗体奠定了理论基础。     

沉默Chk2基因对DADS阻滞人胃癌BGC823细胞G2/M期的影响

细胞周期检测点激酶1/2(Chk1/2)在参与G2/M期起着重要作用,本研究探讨沉默Chk2基因对二烯丙基二硫(DADS)诱导人胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞的影响。采用RNAi 技术沉默BGC823细胞Chk2基因,q-PCR与Western blot检测Chk2 mRNA与蛋白表达。流式细胞术检测DADS与Chk2沉默BGC823细胞周期分布情况。Western blot检测Cdc25C与cyclin B1表达。流式细胞术显示,DADS作用BGC823细胞后,G2/M期细胞呈时间依赖性增加 (P<0.05)。Chk2沉默BGC823细胞Chk2 mRNA与蛋白表达下调 (P<0.05)。Chk2沉默组G2/M期细胞较对照组差异无显著性 (P>0.05)。DADS处理Chk2沉默组与对照组后,两者G2/M期细胞差异无显著性(P>0.05),而较未处理前有明显差异 (P<0.05)。Chk2沉默后,CDC25C和CyclinB1表达较对照组无明显差异 (P>0.05)。但是, DADS处理对照组与Chk2沉默组后,CDC25C和CyclinB1表达较处理前明显降低 (P<0.05)。表明Chk2 沉默对DADS阻滞BGC823细胞G2/M作用没有影响,DADS阻滞G2/M的检查点可能不是Chk2。     

CD44~+胃癌细胞的获取及其干细胞特性的初步鉴定

目的:肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在恶性疾病发生发展中起重要作用,且是肿瘤治疗失败的根源。胃癌细胞系中同样也存在着肿瘤干细胞。本研究目的是通过筛选人胃癌细胞系SGC-7901细胞中的CD44(+)肿瘤干细胞(CSCs)样细胞,然后对其干细胞特征进行初步鉴定。方法:磁珠分选术(MACS)从胃癌SGC-7901细胞中筛选出CD44(+)胃癌细胞,采用免疫荧光流式细胞术、球状体形成、软琼脂集落形成、FCM等实验对其干细胞特性进行初步鉴定。结果:1.免疫荧光流式细胞术分析结果显示,人胃癌SGC-7901细胞系中只有约2.4%的CD44(+)阳性细胞,经过MACS磁珠分选后,CD44(+)亚群的细胞阳性率可以提高到97.4%。将分选后CD44(+)和CD44(-)细胞接种到无血清培养基中观察球形体的形成,结果发现,CD44(+)细胞形成明显的球状体,CD44(-)细胞不形成球形体(P0.05)。将分选后CD44(+)和CD44(-)细胞接种到软琼脂中观察集落形成,发现CD44(+)细胞群有强大的增殖能力,形成集落大且数量多,而CD44(-)细胞群集落少且小(P0.05)。FCM分析显示:CD44(+)细胞G0/G1期百分率明显高于CD44(-)细胞(P0.05)。CD44(+)胃癌细胞比CD44(-)胃癌细胞具有更强的迁移能力。CD44(+)胃癌细胞的体外侵袭能力比CD44(-)细胞明显增强。结论:所获得的CD44+细胞具有胃癌干细胞特性,可作为今后胃癌干细胞研究的实验基础。     

沉默LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭

探讨沉默LIM激酶1(LIMK1)对人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭的影响。采用RNA干扰技术沉默MGC803细胞LIMK1基因,RT-PCR和Western blot检测干扰效率,MTT、流式细胞术、细胞划痕和侵袭实验分别检测沉默LIMK1对MGC803细胞增殖、细胞周期、迁移与侵袭能力的影响。结果显示,成功构建稳定沉默LIMK1基因MGC803细胞。MTT显示,LIMK1沉默组细胞在24、48、72、96 h分别较对照组与空载体组的抑制率为61.0%、36.9%、12.1%、1.6%和54.7%、46.2%、13.5%、1.5%(P<0.05)。流式细胞术显示,沉默组G2/M期17.96%明显高于MGC803组11.45%和空载体组11.68%(P<0.05)。划痕实验显示,24 h后,沉默组划痕距离(155.9±7.6)较对照组(65.9±11.0)和空载体组(73.2±5.1)明显增加(P<0.05)。侵袭实验显示,沉默组穿膜细胞(25.1±1.3)较对照组(42.4±2.8)和空载体组(45.2±3.0)明显减少(P<0.05)。沉默LIMK1可抑制MGC803细胞增殖、迁移与侵袭和阻滞G2/M期。     

miR-924靶向TGM2抑制胃癌MGC803细胞增殖

探讨miR-924影响胃癌MGC803细胞增殖的分子机制。首先预测靶向结合组织型转谷氨酰胺酶(TGM2)的miRNAs,分析miR-924调控TGM2基因3′-UTR结合位点及两者的靶向结合。然后将miR-924导入MGC803细胞,检测其对TGM2表达及MGC803细胞增殖的影响,以及JAK3、STAT3及其磷酸化蛋白表达情况。发现miR-924与TGM2基因3′UTR的864-871位核苷酸靶向结合,并抑制MGC803细胞中TGM2 mRNA及蛋白质表达(P＜0.05)。miR-924高表达后MGC803细胞的生长速度减慢,克隆形成能力降低;JAK3与STAT3蛋白磷酸化水平下调(P＜0.05)。由此得出,miR-924通过靶向抑制TGM2表达,下调JAK3/STAT3通路活化,降低MGC803细胞增殖。     

甲醛致小鼠急性炎性疼痛时脊髓溴结构域结合蛋白4的表达上调

目的探讨溴结构域结合蛋白4(BRD4)在小鼠脊髓中的表达及其在急性炎性疼痛中的作用。方法 36只雌性昆明小鼠,随机分成3组,即对照组;甲醛组:小鼠予以右侧后肢足底皮下注射25μL 1%甲醛溶液;甲醛+吲哚美辛组:小鼠腹腔注射吲哚美辛(20 mg/kg)1 h后注射甲醛溶液,每组12只。立即观察小鼠的自发疼痛行为;用免疫荧光方法检测BRD4在脊髓的细胞定位;免疫组化和Western blot检测双侧脊髓BRD4的表达。结果 BRD4在小鼠脊髓后角浅层主要定位于神经元;甲醛可诱导小鼠出现明显的双相性自发痛;吲哚美辛预处理可明显减轻甲醛诱导的第二相疼痛;与对照组相比,甲醛组小鼠双侧脊髓BRD4的表达明显上调(P0.05);吲哚美辛干预组双侧脊髓BRD4的表达下调(P0.05)。结论脊髓后角浅层BRD4的表达上调可能参与了急性炎性疼痛的调节。     

二烯丙基二硫下调β-catenin抑制人胃癌MGC803细胞EMT

目的　研究二烯丙基二硫（DADS）抑制人胃癌MGC803细胞EMT与形态学变化。　方法　应用相差显微镜与透射电镜观察30　mg·L^-1　DADS处理后的MGC803细胞形态学与超微结构的变化。RT-PCR与Western　blot检测β-catenin和EMT标记E-cadherin与Vimentin表达。　结果　30　mg·L^-1　DADS处理MGC803细胞24　h后,相差显微镜显示,与未处理比较,细胞圆形、椭圆形,核浆比值降低,巢状分布,均未见伪足。透射电镜显示,细胞表面微绒毛数目减少,细胞核变规整,核浆比值下降,异型性降低,细胞与细胞之间出现连接结构,细胞器增多。RT-PCR与Western　blot表明,DADS可呈时间依赖性分别下调MGC803细胞β-catenin和Vimentin　mRNA与蛋白和上调E-cadherin　mRNA与蛋白。　结论　DADS可通过下调β-catenin上调E-cadherin与下调Vimentin抑制EMT和伪足形成。     

HSP90α/β蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

目的　观察热休克蛋白90α/β（heat　shock　protein　90α/β,HSP90α/β）在胃癌组织中的表达及临床意义,为胃癌的早期诊断与分子病理分型提供有价值的实验资料。方法　采用免疫组织化学染色结合组织芯片,观察HSP90α/β蛋白质在正常胃黏膜组织、癌旁组织及胃癌组织中的表达;然后分析HSP90α/β蛋白质在胃癌组织中表达的临床意义。结果　免疫组织化学染色结果显示,胃癌组织中HSP90α/β蛋白质表达的阳性率高于正常胃黏膜组织和癌旁组织（P<0.05）;癌旁组织中表达的阳性率高于正常胃黏膜组织（P<0.05）;淋巴结转移患者组织中表达的阳性率高于无淋巴结转移者（P<0.05）;Ⅲ～Ⅳ期患者组织中表达的阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期（P<0.05）。结论　HSP90α/β蛋白质的表达与胃癌组织的发生、分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关,即随着胃癌组织分化程度的降低、淋巴结转移的发生及TNM分期的增加而表达升高。