Pdxl与NeuroD1联合诱导LO2细胞Nkx6.1和GLUT2的表达

目的:应用分子生物学技术,构建胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)和神经分化因子1(NeuroD1)转录因子真核表达质粒,检测其能否在真核细胞中有效表达并诱导人肝细胞转分化的能力.方法:以人胚胎胰腺组织mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdxl和NeuroD1基因,分别克隆到真核双表达载体plRES质粒的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pl/Pdxl/NeuroD1真核表达质粒,并转染LO2细胞.用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法和Western blotting检测目的基因及NK转录因子相关的Nkx6.1(Nkx6.1)和葡萄糖运载体2(GLUT2)的表达情况.结果:目的基因克隆正确且在真核细胞中有效表达;并可诱导肝细胞表达胰腺B细胞功能相关的Nkx6.1和GLUT2因子.结论:pl/Pdxl/NeuroD1质粒成功构建和在人真核细胞表达,并诱导人肝细胞表达B细胞功能相关的Nkx6.1转录因子和GLUT2,提示Pdxl与NeuroDl可诱导肝细胞向胰腺内分泌细胞分化.     

人骨髓源干细胞向胰岛素分泌细胞分化(英文)

目的：探讨人骨髓源干细胞向具有功能的胰岛素分泌细胞分化的可能性。方法：从人骨髓分离间充质干细胞。采用表皮生长因子、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导其向胰岛素分泌细胞分化。经诱导后,用RT-PCR检测胰岛β细胞相关基因的表达,并采用免疫细胞化学染色检测胞浆胰岛素的表达。此外,诱导后细胞分泌的胰岛素定量及胰岛素释放实验将采用化学发光法进行检测。将经诱导后的细胞移植到糖尿病小鼠的右侧肾被膜下。在移植后16 d持续检测小鼠的血糖水平,最后对右侧肾脏进行免疫组化检测。结果：经诱导后,细胞能表达胰岛β细胞相关基因;免疫细胞化学染色也能检测到胞浆有胰岛素的表达;而且这些细胞能对糖刺激有所反应。细胞被移植到糖尿病小鼠的肾被膜下,能起降血糖作用。其肾脏的免疫组化显示：肾被膜下有胰岛素阳性细胞。结论：人骨髓源干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能,这将为糖尿病细胞治疗提供丰富的细胞来源。     

抗原特异TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCRV β13-pIRES2-EGFP真核表达载体的构建及共转染研究

目的 构建携带弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异性的TCR Vα和TCR Vβ基因片段的真核表达载体TCR Vα-pIRES2.EGFP和TCR Vβ-plRES2-EGFP,将其共同转染Raji和Jurkat细胞.方法 前期研究从1例DLBL患者外周血T细胞中发现克隆性增殖T细胞受体(TCR)Vα6和Vβ13亚家族T细胞,在此基础上利用RT-PCR扩增TCR Va6和TCR Vβ13基因全长序列后,分别将其定向克隆入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP,酶切和核酸序列测定分析方法鉴定重组质粒TCR Vα6-pIRKS2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP的正确性;利用核转染技术(nueleofector)将其分别或共同转染Raji细胞和Jurkat细胞,24 h后利用激光共聚焦显微镜观察EGFP的瞬时表达情况,48h后利用实时定量PCR检测TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达情况,Western blot检测EGFP蛋白的表达情况.结果 获得来自DLBL患者的TCR Vα6和TCR Vβ13基因全长序列,酶切分析和核酸序列测定证实TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP重组质粒构建正确;转染24 h后,激光共聚焦显微镜下可观察到EGFP的表达,40%以上细胞发出绿色荧光,单独转染和共转染组荧光产生情况相似;实时定量PCR在单独转染和共转染组均町检测到TCR Vα6和TCR Vβ13基因的表达,共转染组2基因的表达水平稍低于单独转染组;Western blot检测在单独转染和共转染组均显示EGFP蛋白的表达,2组的蛋白杂交带强度相似.结论 成功构建了DLBL特异性的TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCR Vβ13-pIRES2-EGFP真核表达质粒,两者可同时转染到细胞中,并实现了体外共表达.     

胰腺β细胞分化的信号通路调控

细胞替代治疗给糖尿病的根治带来了新希望。文章综述了近年来干细胞向胰岛细胞定向分化的分子研究进展,综合分析细胞信号通路在β细胞分化发育过程中所发挥的作用。其中Wnts信号是通过阻止β-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录,促进干细胞向内胚层分化;Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响,当Notch活性被抑制时,干细胞进入分化程序,发育为功能细胞;Hedgehog信号转导对许多发育过程是必须的,其主要以浓度依赖方式控制细胞的增殖、分化和组织的形成,这些信号通路按一定的顺序上调或下调,以启动PDX1等β细胞分化相关的转录因子的表达,从而调控着β细胞的分化发育。因此深入分析并通过调控这些信号通路为以后进行相关细胞定向分化,获取发育成熟、功能完整的β细胞,进行细胞治疗糖尿病奠定基础。     

骨髓间充质干细胞治疗慢性移植物抗宿主病后患者外周血T细胞受体Vβ亚家族谱系变化研究

 目的　研究输注骨髓间充质干细胞（MSC）治疗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）后患者外周血T细胞受体（TCR）Vβ基因谱系变化及克隆性增殖情况。方法　1例经异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后发生cGVHD的患者接受MSC治疗,分别于第1次输注MSC后第1、5天及第2次输注MSC后第1、10、20天采集外周血,同时将输注的MSC作为对照,利用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3（CDR3）,PCR 产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,从而确定T细胞的克隆性。结果　患者输注的MSC不表达全部TCR Vβ亚家族,第1次输注MSC后第1天也未发现TCR Vβ亚家族的表达,随后的时间点分别出现了3、10、14、10个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式以寡克隆、多克隆为主;临床判断cGVHD表现减轻。结论　MSC对allo-HSCT后患者免疫功能的恢复有一定作用,并能减轻cGVHD效应;TCR Vβ亚家族谱系分析提示有部分优势表达。     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对活化T细胞端粒长度影响及其相关机制研究

目的:研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对T细胞端粒长度的作用及机制。方法:SEA、K562细胞、SEA联合K562细胞以及抗CD3单克隆抗体分别刺激脐带血单核细胞,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测端粒、hTERT及IL-7R表达。结果:SEA组、K562细胞组、SEA联合K562细胞组及抗CD3单抗组活化T细胞的端粒相对长度比值为1.63±0.08、1.06±0.06、3.24±0.61、1.37±0.07;hTERT的表达差异倍数为1.88±0.07、1.95±0.05、3.93±0.23、1.30±0.06;IL-7R表达差异倍数为6.61±0.52、12.81±0.34、17.42±0.50、4.87±0.66;SEA联合K562细胞组均明显高于其他3组(P<0.01),SEA组对端粒长度影响大于单纯K562细胞组。结论:超抗原SEA可以直接刺激T细胞的端粒酶活性及上调表达IL-7R,联合特异性抗原K562细胞株诱导T细胞活化上调效果更明显。     

儿童大剂量移植HLA不相合双亲供者的纯化外周血CD34+祖细胞

对于许多恶性和非恶性疾病来说,进行清髓性造血祖细胞异基因移植是唯一行之有效的治疗措施,但大多数需要移植的患者无组织相容性的同胞供者。与同胞移植相比,无关供者移植的移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥和感染的发病率及严重程度均增加,故移植效果较差。     

四种不同的同种异基因移植法治疗第一慢性期慢性粒细胞白血病患者嵌合现象和微小白血病残留的比较研究

最近,陆续出现了代替传统骨髓移植(BMT)和外周血千细胞移植(PBSCT)的新的治疗血液系统恶性肿瘤的异基因移植方法,其中之一是Slavin等报道的减量预处理后PBSCT,此种移植的特征为预处理过程对相关器官的毒性降低,从而使患者对移植的耐受性增强,同时亦为老年及有严重并发症的患者提供了异基因移植的机会。     

Neuropilin-1基因在CML骨髓基质细胞中的表达及其意义

目的　了解Neruophlin -1基因在慢性粒细胞白血病 (CML)骨髓基质细胞中的表达情况 .方法　收集 14例CML和 2 0例正常对照骨髓标本 ,分离单个核细胞 .进行体外长期培养 ,收集贴壁细胞 (骨髓基质细胞 ) .利用RT -PCR方法分析两组骨髓基质细胞中的cDNA ,了解Neuropilin -1基因表达情况 .结果　建立了CML和正常人骨髓基质细胞培养方法 ,CML骨髓基质细胞中的Neuropilin -1基因表达率 (50 % )明显低于正常对照 (85% ) (p <0 .0 5) .结论　参与调控骨髓基质细胞的Neuropilin -1基因可表达于大部分正常人和部分CML患者骨髓基质细胞中 ,Neuropilin -1基因在部分CML骨髓基质细胞中的表达缺失可能与其调节造血功能异常有关     

苯中毒患者胸腺近期输出功能和T细胞亚群变化

目的　分析职业性慢性轻度苯中毒工人外周血单个核细胞中信号结合T细胞受体删除DNA环 (sjTRECs)的含量和CD4+/CD8+比值 ,从而了解其初始 (naive)T细胞含量和胸腺近期输功能 ,以及外周T细胞亚群分布情况。方法　利用间接免疫荧光法检测 11例健康人和 5例轻度苯中毒患者外周血单个核细胞中CD4+/CD8+比值 ;采用实时荧光定量聚合酶链反应 (real timePCR)和TaqMan方法检测两组外周血单个核细胞中sjTRECs的含量。结果　每 10 0 0个外周血单个核细胞中sjTRECs含量在正常人中为 9 10± 4 5 5 ,轻度苯中毒为 2 80± 3 79,P <0 0 5 ;轻度苯中毒者CD4+/CD8+的比值 (0 92± 0 3 5 )明显低于正常人 (1 49± 0 2 1) ,P <0 0 1。结论　轻度苯中毒患者胸腺近期输出功能低下 ,长期低剂量接触苯可能引起一些工人的细胞免疫功能障碍