外周血MSCs的分离培养及对G-CSF的动员反应

目的建市多种种属外用血间充质干细胞（MSCs）的分离培养方法，探讨其对粒细胞集落刺激因子（G—CSF）的动员反应。方法用percoll（1．131g/mL）分离多种种属外周血单个核细胞，进行贴壁培养MSCs。以G-CSF作为动员剂，培养骨髓和外周血来源的MSCs，计数动员前后的成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）。结果对多种种属进行外周血MSCs分离培养，成功率不同。在本实验条件下．可以稳定的直接分离培养出大鼠外周血的MSCs。G—CSF动员后，骨髓来源MSCs的CFU-F数昔显著高于对照组（P〈0．01）；外周血来源MSCs的CFU-F数量也显著高于对照组（P〈0．01），接近4倍。结论不同种属外周血MSCs分离培养难易不同，其直接原因是生理条什下外周血中存在的MSCs量少导致的。G—CSF可以有效地动员大鼠骨髓和外周血MSCs。     

间充质祖细胞源性的神经元样细胞肌内移植后自身特性的维持

目的探讨间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells,MPCs)源性的神经元样细胞肌内移植后能否维持其自身特性。方法取3周龄健康GFP转基因C57小鼠后肢长骨进行MPC培养及鉴定,选取生长良好的第3代MPC,采用神经元原代培养上清液进行神经元样细胞诱导分化后收集细胞,并制备成5×105/μL细胞悬液备用。选取12周龄健康C57小鼠24只,按随机数字表法分为损伤+移植细胞组、损伤+生理盐水组、假手术+移植细胞组、假手术+生理盐水组。损伤+移植细胞组及假手术+移植细胞组:将制备的5μL MPC悬液散点注入小鼠三头肌内;损伤+生理盐水组和假手术+生理盐水组:同法注入等量生理盐水。术后4周取材,荧光显微镜下观察肌内移植细胞存活情况,电镜观察肌肉超微结构的变化,免疫荧光染色检测神经元特异性标志物NSE、NeuN及神经胶质特异性标志物GFAP的表达情况。结果肌内移植细胞生长良好且均匀分布于肌细胞间隙,并抑制了肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化的发生。损伤+移植细胞组定植存活的移植细胞阳性表达:NSE(58.35±1.37)%、NeuN(60.22±0.16)%及GFAP(13.32±1.65)%,损伤+生理盐水组、假手术+移植细胞组、假手术+生理盐水组均无阳性细胞表达。结论 MPC具有良好的生物学活性,经体外诱导分化为神经元及神经胶质样细胞后移植于失神经支配肌内可定植存活,并能够维持神经元及神经胶质样细胞的特性,同时有效抑制了肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化的发生。     

腹盆腔放疗诱发肠道微生态失调与肠源性感染的实验研究

目的 探索腹盆腔放疗照射对肠道微生态的影响及其与肠源性感染的关系。方法 模拟腹盆腔放疗照射BALB/c小鼠,2.0 Gy/d,连续照射5 d/周,分别于照射3周、5周和6周后停照1周的时间点收集回肠组织及其内容物样本。用实时定量RT-PCR检测抗菌肽和促炎性因子的表达;用PCR检测细菌在小鼠体内的移位情况;用变性梯度凝胶电泳技术检测分析肠道微生态的特征。结果 腹盆腔照射诱发了肠道潘氏细胞隐窝素-1和-4表达紊乱,照射3周或照射6周后停照1周,小鼠回肠隐窝素-1和-4均呈现显著性降低(t=-7.43、-3.54、-4.72、-4.27,P<0.05);而照射5周小鼠回肠隐窝素-1和-4表达明显升高(t=6.15、5.75,P<0.05)。放疗模拟照射3和5周时小鼠肠道微生物区系多样性指数和丰富度显著降低(t=-3.49、-4.19、-3.44、-4.97,P<0.05),呈现以乳酸杆菌等益生菌减少,大肠杆菌和弗氏志贺氏菌等条件致病菌增多为特征的微生态失调。受照小鼠肠系膜淋巴结和血液中的细菌DNA阳性率明显增高。照射3和5周后回肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α显著性高表达(t=4.85、6.16、7.71、4.60、4.86、5.97,P<0.05);照射6周后停照1周时,肠道促炎性因子的表达量有所回落,但IL-1β和TNF-α的表达量仍显著性高表达(t=3.67、5.88,P<0.05)。结论 腹盆腔放疗可诱发肠道抗菌肽表达紊乱,引起肠道微生态失调,进而导致肠源性细菌移位及感染性炎症的发生。微生态可能成为减轻放疗患者消化道不良反应的有效干预靶点。     

人TALL-1可溶性功能片段在毕赤酵母中的分泌表达

目的在毕赤酵母系统中分泌表达具有生物活性的人TALL-1基因胞外区片段（sTALL-1）。方法构建酵母重组表达质粒pPIC9K-sTALL-1,电转化法将SacI线性化的重组质粒转导入毕赤酵母菌GS115中,经G418筛选获得高拷贝转化子及表型鉴定后,用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果成功构建酵母重组表达质粒pPIC9K-sTALL-1;甲醇诱导表达后,sTALL-1在酵母培养基中得到分泌表达;Westernblot和ELISA检测证实重组产物可以结合其特异抗体;MTT检测证实其对Hela细胞具有细胞毒效应。结论在毕赤酵母系统中实现了人sTALL-1的分泌表达。     

人子宫内膜细胞原代培养方法的改良

目的 寻求一种简便高效的人子宫内膜上皮细胞和间质细胞分离、纯化与鉴定方法,建立稳定的子宫内膜细胞体外培养体系.方法 简化Ryan等的子宫内膜细胞原代培养方法的取材,分离和培养条件,分离出高纯度的子宫内膜上皮细胞和间质细胞进行体外培养和传代.结果 培养成功的子宫内膜上皮细胞与间质细胞均可稳定传代,体外生长10～50 d,纯度均达90%以上.结论 该方法简便高效,可建立稳定的人子宫内膜细胞体外培养体系.     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究

目的探讨微小RNA（microRNAs）分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型，Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱，转染DNA／LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究，RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型，2个分子在分化过程中均表达上调，且它们具有各自的组织分布特点；建立了以DNA／LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台；与对照组比较，抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化，说明这2个分子对于分化的进程影响不大。     

放烧复合伤的发病机制与救治研究

放射损伤合并烧伤的放烧复合伤,主要见于战时核爆炸与平时核事故,也见于贫铀弹伤害、核恐怖"脏弹"袭击等情况.两伤合并后,伤情更重,救治更难,预后更差.国内外对此研究较为重视,国外以俄、美、法等国,特别是俄罗斯Budagov项目组对放烧复合伤研究较多[1].国内复合伤研究始于20世纪50年代后期,目前主要集中于第三军医大学[2].由于放烧复合伤早期休克发生率高,感染出现早而重,出血及造血障碍显著,创面愈合慢,极大地影响其预后转归和治疗[3].针对这些重要的发病环节,本综述主要从早期抗休克与心功能保护、抗放药物应用、复合伤创面处理等3方面进行了较为深入的系列研究.     

贫铀长期摄入对大鼠某些性激素水平和睾丸的影响

目的 研究贫铀低剂量长期摄入后对大鼠某些性激素含量及睾丸超微结构的改变.方法 摄入组为初断乳35～55 g大鼠,以含有50 μg/L和70 μg/kg的贫铀饮水及饲料喂食大鼠.采用放射免疫分析法检测贫铀摄入后3个月大鼠体内卵泡刺激素、问质细胞刺激素和睾酮水平,并分别在摄入贫铀后3、6、12和18个月进行大鼠睾丸的病理组织学及超微结构观察.结果 性激素水平测定发现睾酮、间质细胞刺激素、卵泡刺激素含量在贫铀接触后有不同程度的改变.分别为(2.92±1.03)nmol/l,(0.865±0.18)mIU/ml和(0.243±0.079)mIU/ml.睾丸病理组织学检查发现间质细胞增生,后期出现曲细精管的萎缩.结论 长期贫铀摄入可引起大鼠睾丸某些性激素水平变化和致睾丸损伤.     

骨髓源性干细胞的异质性及在肠道修复中的作用研究进展

目的 对骨髓源性干细胞(bone marrow derived stem cells,BMDSCs)的异质性及其形成机制和意义进行综述,分析其在肠上皮重建中的作用和可能机制.方法 查阅和分析近年有关BMDSCs异质性和其在肠上皮损伤修复中作用的相关文献,并作进一步综合分析.结果 BMDSCs异质性可以解释其多向分化能力,可能以直接定植于肠道或通过和肠道干细胞融合以及促进损伤微环境的重建等多种机制参与肠上皮功能修复.结论 BMDSCs在炎症性肠病等胃肠道损伤和修复中具有广阔的应用前景.