γ-干扰素对大鼠胚胎基底前脑及隔区核团胆碱能神经元分化的影响

为了研究γ-干扰素(IFNγ)对大鼠胚胎基底前脑及隔区核团胆碱能神经元分化的作用,采用免疫组织化学方法对胆碱能神经元的特异性标记酶-胆碱乙酰基转移酶(ChAT)进行染色,ChAT阳性细胞的数量反映了胆碱能神经元的数量,并用14C-乙酰CoA作底物来检测ChAT活性。结果显示,IFNγ处理过的实验组,ChAT阳性细胞数量显著增加,ChAT活性也增加,这种增加被大鼠抗小鼠IFNγ单克隆抗体(Ab-IFNγ)完全拮抗。采用流式细胞术对细胞周期进行分析,细胞周期及细胞百分率无明显改变。用MAP2标记神经细胞,神经细胞数基本未增加。以上结果提示:IFNγ不能促进基底前脑和隔区神经元增殖,胆碱能神经元表达增加不是因为神经元数目增加而是分化的结果。     

实体瘤CAR-T治疗的挑战与展望

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)治疗是通过体外改造T细胞,使其能特异性识别和杀伤肿瘤细胞,从而达到肿瘤治疗目的的一种新技术。目前,CAR-T治疗相关的临床试验正在全世界范围内广泛开展,CD19靶点的CAR-T在治疗血液肿瘤方面取得了革命性的成功,CAR-T疗法正成为继手术、放疗、化疗之后的又一新的肿瘤治疗方法。然而,对于癌症中的主要类型实体瘤,目前CAR-T治疗的研究依然缺乏实质性进展。本文以实体肿瘤的CAR-T治疗为切入点,简要概述了实体肿瘤相较于血液肿瘤的特征和治疗难点,以及目前CAR-T治疗实体瘤面临的主要挑战及展望。     

血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源神经干细胞增殖的促进

目的:观察血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源的神经干细胞增殖的促进作用,为临床治疗提供实验依据。方法:实验于2003-10/2005-05在北京大学医学部干细胞研究中心完成。小鼠胚胎干细胞在不含有白细胞抑制因子的条件下形成类胚体,经过7d选择性培养得到神经干细胞,利用免疫荧光的方法检测神经干细胞标志物nestin以及sox-2的表达情况;将神经干细胞与血管内皮生长因子共培养,通过氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入的方法测定细胞的增殖速度;在外源性血管内皮生长因子存在的情况下,利用受体2中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体,观察外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结果:经鉴定胚胎干细胞来源的神经干细胞(95±3)%以上表达神经干细胞标志物nestin以及sox-2,该细胞在体外可以传代。与血管内皮生长因子共培养后,发现随着血管内皮生长因子浓度的升高神经干细胞增殖速度明显加快。通过中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体2可以阻断外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结论:实验中诱导小鼠胚胎干细胞得到了高纯度的神经干细胞,血管内皮生长因子能够通过血管内皮生长因子受体2促进神经干细胞增殖。     

全合成Jaspine B诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡及DNA损伤

目的研究全合成Jaspine B对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用,并探讨其对细胞DNA的损伤。方法酸性磷酸酶法(APA)检测细胞增殖,荧光显微镜、透射电镜(TEM)观察细胞形态结构,DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化,流式细胞技术检测凋亡率及线粒体膜电位(ΔΨm),Western blot检测凋亡相关蛋白表达,单细胞凝胶电泳(SCGE)检测DNA损伤。结果Jaspine B抑制细胞增殖,24、48、72h IC50分别为2.61、1.07、0.77μmol·L-1,其作用在一定范围内呈浓度和时间依赖性;细胞发生凋亡形态改变,生化特征上出现DNA梯状改变;1.50μmol·L-1及3.00μmol·L-1Jaspine B作用24h,早期凋亡细胞率分别为7.60%及15.48%,相应浓度作用48h,早期凋亡细胞率分别增至21.48%及23.60%;Jaspine B可引起ΔΨm明显下降、Cyt C水平增加,促使Caspase-3酶原剪切活化;Jaspine B作用24h,细胞出现明显DNA损伤。结论全合成Jaspine B对人乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制增殖、诱导凋亡并诱发DNA损伤,凋亡经由依赖胱天蛋白酶的内在途径发生。     

脂蟾毒配基通过线粒体途径诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡的研究

目的：探讨中药蟾酥主要成份之一脂蟾毒配基（Resihufogenin，RG）诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡的作用机制。方法：体外培养Bel-7402细胞．采用酸性磷酸酶法检测RG对细胞增殖抑制作用：吖啶橙荧光染色观察细胞形态变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体膜电位（△ψm）变化；Westem Blot检测与细胞调亡相关蛋白表达的变化。结果：RG显著抑制细胞增殖，其作用24、48、72h的IC50分别为3．8、1．8、1．2μmol／L；经10μmol／LRG处理24h后，癌细胞出现凋亡的形态变化，其凋亡率明显高于对照组细胞；RC引起△ψm下降，释放入胞质中的细胞色素c（cytochrome c，CytC）增多，促进caspase-3蛋白活化，抑制Bel-2蛋白表达。诱导细胞凋亡。结论：RG诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡．其诱导凋亡作用可能通过线粒体通路实现。     

60Coγ射线诱导的新生大鼠大脑皮质神经细胞凋亡

目的 采用电离辐射诱导的新生大鼠大脑皮质神经细胞损伤模型,探讨电离辐射诱导发育脑神经细胞死亡的特征和机制。方法 新生大鼠接受单次2.0 Gyγ射线照射后,采用DNA凝胶电泳、TUNEL和HE染色鉴定大脑皮质神经细胞死亡的类型和时程变化特点;应用免疫组织化学方法研究p53和iNOS在细胞死亡过程中的可能作用。结果 DNA凝胶电泳、TUNEL和HE染色表明,2.0 Gyγ射线照射可诱导新生大鼠大脑皮质神经细胞凋亡。大脑皮质各区域凋亡指数于照射后4 h开始增高,至12 h达到峰值;照射后相同时间点各皮质区域凋亡指数比较,新皮质最高,海马次之,旧皮质最低;P53和iNOS免疫阳性细胞计数定量结果显示,照射后相同时间点各皮质区域P53和iNOS免疫阳性细胞数差异无统计学意义。结论 2.0 Gyγ射线照射诱导了新生大鼠大脑皮质神经细胞凋亡;不同皮质区域的神经细胞对电离照射引起的损伤反应是相似的,但不同皮质区域的神经细胞凋亡存在差异。     

脂蟾毒配基对人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预效应

目的：观察中药蟾酥主要成分之一——脂蟾毒配基对体外培养人胃癌BGC-823细胞系细胞生长的干预及其与细胞色素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化的关系。 方法：实验于2004—09／2005—12在北京大学医学部细胞生物学系实验室完成。体外培养人胃癌BGC-823细胞系，脂蟾毒配基各组加入不同浓度的脂蟾毒配基（先用二甲基亚砜溶解，再经RPMI-1640培养液稀释至终浓度。细胞增殖及增殖抑制实验、细胞核形态观察及核DNA含量测定实验中脂蟾毒配基浓度分别为0．1，1，10μmol／L；细胞周期分布实验、细胞凋亡率实验、线粒体膜电位实验中脂蟾毒配基浓度分别为0，1,2．5，5μmol／L）。空白对照组加入RPMI-1640培养液。盐酸阿克拉霉素组加入5μmoL／L盐酸阿克拉霉素。采用酸性磷酸酶法检测细胞增殖抑制作用；细胞荧光分光光度仪观察细胞核形态及核DNA含量测定；流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及其线粒体膜电位变化；Western blot检测与细胞凋亡相关基因蛋白表达的变化。 结果：①经0．1，1，10μmol／L脂蟾毒配基分别作用24，48，72h后，细胞生长显著抑制，脂蟾毒配基对癌细胞的生长抑制百分率与剂量、时间呈正相关，其IC50分别为3．9，2．0，1．5μmol／L。②随脂蟾毒配基作用浓度和时间的延长，癌细胞核荧光强度减弱，细胞核DNA含量明显降低。③0．1，1μmol／L脂螗毒配基作用24～48h后癌细胞阻滞在S期，5μmol／L脂蟾毒配基作用72h时，细胞阻滞在G2＋M期；盐酸阿克拉霉素与癌细胞作用24～48h，细胞阻滞在S期，作用72h时细胞阻滞在G2＋M期。④脂蟾毒配基作用后，细胞凋亡率明显高于对照组。⑤脂蟾毒配基引起细胞线粒体膜电位下降，释放人胞质中的细胞色素C增多，促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白活化，抑制Bel-2蚤白表达，诱导细胞凋亡。 结论：体外实验条件下，脂蟾毒配基抑制人胃癌BGC-823细胞生长并诱导细胞发生凋亡，其诱导凋亡作用机制与线粒体通路有关。     

OSKM诱导过表达c-Jun肝癌细胞重编程

目的构建OSKM诱导的过表达c-Jun肝癌细胞(C3A-c-Jun)重编程细胞系,探讨外源性c-Jun对肝癌细胞重编程的影响。方法通过C3A细胞稳定过表达c-Jun后进行OSKM诱导重编程,通过碱性磷酸酶染色,Real-time PCR,免疫印迹法,免疫荧光等技术对细胞进行鉴定,建立C3A-c-Jun诱导肿瘤干细胞系C3A-c-Jun-i CSCs。结果 C3A-c-Jun-i CSCs克隆呈圆顶状,边缘圆钝,克隆内细胞小且排列紧密,多层分布,碱性磷酸酶染色阳性,mRNA和蛋白水平均可表达多潜能性标记物OCT4、SOX2;C3A-c-Jun-i CSCs组外源性和内源性Sox2的表达量均明显高于C3A-i CSCs对照组;在重编程过程中c-Jun持续表达。结论 OSKM诱导C3A、C3A-c-Jun肝癌细胞重编程,分别建立C3A-i CSCs和C3A-c-Jun-i CSCs细胞系,发现外源性c-Jun通过上调Sox2基因的表达,启动下游一系列反应,对肝癌细胞重编程过程起促进作用。     

当归补血汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注后大脑皮质神经元的保护作用

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后当归补血汤对大脑皮质神经元的保护作用。方法雄性SD大鼠48只随机分为假手术组、大脑中动脉阻塞再灌注组、生理盐水对照组、当归补血汤治疗组。治疗组术前连续6d灌胃,每日2次(早、晚各1次),术后4h再灌胃2次,每次2.5ml,次日取材。观察各组大鼠神经行为学缺陷;脑梗死体积和梗死率变化;血脑屏障通透性变化;大脑皮质神经元的形态和数量;大脑皮质神经元p53和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达情况以及大脑皮质凋亡神经元的形态和数量。结果与缺血再灌注组、生理盐水对照组比较,当归补血汤治疗组2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色显示大脑皮质梗死区体积减少(P0.05);荧光显微镜观察脑组织中伊文斯蓝的含量减少(P0.05),Nissl染色显示大脑皮质神经元数量增加(P0.05);免疫组织化学方法显示大脑皮质神经元Caspase-3、p53的阳性细胞数减少(P0.05);TUNEL染色法显示大脑皮质神经元凋亡细胞减少(P0.05)。结论当归补血汤治疗组能减少大脑皮质神经元的死亡,这与其减少大脑皮质神经元Caspase-3、p53的表达,并通过减少细胞凋亡起保护作用有关。     

合成紫花茄皂甙诱导人肝癌细胞株Bel-7402凋亡的作用机制

背景与目的:紫花茄(SolanumindicumL.)是一种有抗炎和治疗跌打损伤作用的传统中草药,含有丰富的结构独特的薯蓣皂甙,即紫花茄皂甙。我们的研究结果已证实,数种合成紫花茄皂甙有强抗肿瘤效果。本研究探讨合成紫花茄皂甙Ⅰ("-D-木吡喃糖基-(1→3)-[#-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)]-"-D-半乳吡喃糖基薯蓣苷)的抗肿瘤机制。方法:以不同浓度紫花茄皂甙处理人肝癌细胞Bel-7402后,用酸性磷酸酶(acidphosphataseassay,APA)法测定增殖抑制率和IC50。用结晶紫染色显微镜观察细胞的形态学变化。用蛋白免疫印迹法检测凋亡过程中相关蛋白的变化。结果:紫花茄皂甙对Bel-7402细胞有明显的增殖抑制作用,在皂甙Ⅰ作用72h后的IC50为4.20μg/ml。光学显微镜下可见细胞密度降低,胞质中出现膜泡等形态学变化。蛋白免疫印迹检测结果显示,紫花茄皂甙Ⅰ作用后细胞质中的细胞色素c含量明显增加,Caspase-3被激活,细胞内的poly(ADR-ribose)polymerase(PARP)蛋白被剪切。结论:紫花茄皂甙对人肝癌细胞的增殖抑制呈浓度相关性,且通过线粒体依赖性通路诱导肿瘤细胞凋亡。