重组人Bcl-2腺病毒载体的构建与鉴定

目的　构建人bcl-2重组腺病毒载体。方法　通过酶切分析获得正向插入目的基因的真核表达载体pcDNA/bcl -2 ,然后将bcl -2定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV中 ,通过体内同源重组 ,重组质粒与质粒pJM17共转染 2 93细胞 ,获得复制缺陷型重组腺病毒AdCMV/bcl -2 ,进行扩增、纯化。通过PCR检测病毒DNA ,空斑实验检测病毒滴度。结果　腺病毒穿梭质粒与pJM17体内同源重组后获得含目的基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 2 0× 10 1 0 pfu/ml。结论　基因重组腺病毒载体能成功获得高滴度含目的基因的腺病毒     

兔转化生长因子-β2基因的克隆及其表达的检测

目的　克隆兔转化生长因子 β2 (TGF β2 )基因 ,并获得其在兔重要脏器及角膜中的表达。方法　利用不同物种的相似序列设计相关引物 ,制备兔肝组织的RNA并逆转录 ,RT PCR技术获得TGF β2 基因蛋白编码区序列后克隆 ,RT PCR半定量及荧光定量PCR检测TGF β2 在兔重要脏器及角膜中的表达。结果　成功地克隆了兔TGF β2 的蛋白编码区序列 ,测序证实和人、大鼠及小鼠具有高度的同源性 ,含有TGF β2 的保守结构域 ,TGF β2 基因在兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺和角膜组织中均有不同程度表达。结论　利用同源序列克隆进化上保守的基因是简捷快速的方法。获得兔TGF β2 的基因有助于进一步研究其在机体重要脏器纤维化、肿瘤以及角膜疾病中的作用     

实时荧光聚合酶链反应定量检测LASIK术后兔角膜纤维连接蛋白1的表达

目的　定量检测纤维连接蛋白 1(fibronectin 1,FN1)在LASIK术后不同时段角膜中的表达水平 ,探讨FN1与LASIK术后早期伤口愈合的关系。方法　 2 0只新西兰白兔 ,左眼按近视 4D行LASIK术 ,右眼作对照组。分别于术后 4、4 8h ,1、2周取角膜 ,荧光半定量PCR方法检测中央手术区及周边非手术区角膜FN1mRNA的表达。结果　LASIK术后 4h左眼手术区FN1的mRNA表达水平比右眼相应对照区明显升高 ,4 8h降低至对照组水平 ,其后随时间的延长无明显改变。结论　实时荧光定量PCR定量检测FN1在角膜中的表达结果提示 ,FN1参与LASIK术后角膜瓣与基质床的粘附过程     

RP-HPLC测定尿液中阿魏酸哌嗪的含量

目的 建立尿液中阿魏酸哌嗪含量的测定方法.方法 采用RP-HPLC法,色谱条件为:AlltechC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(35:65,pH3.8);流速1.0ml/min;检测波长310nm;柱温40℃结果阿魏酸哌嗪在0.06μg/ml-2.5μg/ml浓度范围内线性关系良好(r=0.999 9),低、中、高三种浓度(0.5、1.0、2.0μg/ml)溶液,加样回收率分别为98.41%、99.85、98.65%,RSD分别为1.02%、0.98%、0.87%(n=5).结论 该方法能灵敏、准确的测定尿液中阿魏酸哌嗪的含量.     

Bcl-2对免疫抑制剂培养中胰岛细胞的保护作用

目的探讨免疫抑制剂对体外培养的大鼠胰岛细胞的毒性作用以及抗凋亡基因Bc l-2对胰岛细胞的保护作用。方法腺病毒介导的基因转染后表达Bc l-2的大鼠胰岛细胞和对照胰岛细胞分别加入不同浓度的他克莫司培养基中,48 h后检测胰岛细胞的凋亡率和分泌胰岛素的功能。结果低剂量和高剂量的他克莫司都能诱导胰岛细胞凋亡,减少胰岛素分泌,Bc l-2能抑制凋亡,改善胰岛素分泌。结论他克莫司对体外培养的大鼠胰岛细胞有直接的损害作用,而Bc l-2能防治这种损害作用。     

经皮经肝穿刺胆道引流管周腹膜组织粘连实验研究

目的探讨经皮经肝穿刺胆道引流管周围组织组织粘连情况及其与时间关系,以期为临床缩短经皮经肝胆道内镜(PTCS)治疗间期的可行性提供科学实验依据。方法雄性小家猪随机分为4组:即术后第3、5、7、14 d共4组。开腹逆行穿刺置管形成模型,观察引流管周围腹膜之间的组织组织粘连情况并分级。结果所有模型管周腹膜间出现组织粘连,注入美蓝未见变色,而除管周外其他腹膜间没有组织粘连。其中3 d组组织粘连以Ⅱ级为主;5 d后各组组织粘连以Ⅲ级为主。经秩和检验统计学分析示3 d组与其他各组比较,差异有统计学意义(D≥176.2,P<0.05);5 d组、7 d组及14 d组组间比较,差异无统计学意义(D<176.2,P>0.05)。结论经皮经肝穿刺胆道引流(PTCD)术后第5 d经皮肝穿刺胆道引流引流管周围己形成完整致密组织粘连。     

不同胎龄人胎脑神经干细胞发育特征探讨

目的:探讨不同胎龄胎脑纹状体神经干细胞的发育特征。方法:收集胎龄16~28周的水囊引产胎儿60例,采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑纹状体神经干细胞的分布、形态以及数量进行检测。结果:不同胎龄胎脑纹状体均存在神经干细胞,神经干细胞主要分布在豆状核和尾状核,内囊处较少,呈圆形、椭圆形、三角形及多角形细胞,以椭圆形细胞多见,细胞有0~3个突起,胞核呈圆形和椭圆形,1~4个核仁不等,大部分细胞染色质疏松,少部分细胞染色质致密。随着胎龄的增加,纹状体神经干细胞逐渐减少。结论:不同胎龄人胎脑纹状体神经干细胞在形态及数量上存在一定的差异,而在分布部位无明显差异。     

急性心肌梗死诊断和治疗指南对基层医院开展二级预防的影响

目的探讨急性心肌梗死诊断和治疗指南（简称为指南）对我院心肌梗死后病人二级预防的影响.方法回顾分析2000年1月～2004年12月间我院确诊的急性心肌梗死病例,并进行长期随访.对比2001年指南发布前后心肌梗死后病人二级预防状况的差异.结果共有375例病人入选,指南发布前（2000年1月～2001年12月）165例,发布后（2003年1月～2004年12月）210例.指南发布后,β-受体阻滞剂和他汀类降脂药的使用率均较指南发布前显著提高（χ^2=3.87、64.40,P〈0.01、0.05）;低密度脂蛋白胆固醇水平较前显著降低（t=2.59,P〈0.05）;梗死后心绞痛和脑卒中发生率较前显著降低（χ^2=6.60、4.10,P〈0.05）.结论 2001年指南发布后我院心肌梗死后二级预防水平逐步提高,病人预后显著改善.     

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能，构建人4-1BBI。转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBI。全长基因，继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／4-1BBI。与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。^3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响，ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明，L929／4．1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明，L929／4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因，构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929／4-1BBL，该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号，促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。     

吡格列酮对高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞中CT-1的影响

目的：观察心肌营养素 1(CT 1)在高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞中的表达，以及吡格列酮对其表达的影响。方法：体外培养乳鼠心肌细胞，分组给药后，检测心肌细胞肥大的指标：心肌细胞的表面积(图像分析法)、蛋白含量(考马斯亮蓝法)、心房利钠因子(ANF) mRNA的表达(RT PCR法)；同时用半定量RT PCR检测CT 1 mRNA的表达。结果：高糖高胰岛素组心肌细胞表面积、蛋白含量、ANF mRNA表达以及CT 1 mRNA水平均升高(P<0.01)，而吡格列酮治疗组降低(P<0.05)。结论：高糖高胰岛素诱导的肥大心肌中CT 1表达上升，而吡格列酮能抑制其表达，推测CT 1可能参与了高糖高胰岛素所引起的心肌肥大的发生，而吡格列酮抑制心肌肥大的作用可能是通过抑制CT 1介导的。