大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

巢式序列特异性引物PCR方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合的临床应用研究

目的探索临床应用巢式序列特异性引物聚合酶链式反应（PCR-SSP）方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的可行性。方法选取25对拟行HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗的实体肿瘤患者及其供者,供受者为母子关系15例,父子关系10例。采集供受者外周血提取基因组DNA,采用巢式PCR-SSP方法检测患者外周血中供者来源的HLA-DRB1位点,并计算母胎微嵌合阳性率。随机选取经巢式PCR-SSP证实嵌合阳性和阴性且供受者性别不同的患者各4例,采用荧光原位杂交（FISH）技术进行重复检测,并与巢式PCR-SSP方法的检测阳性率进行比较,同时采用噻唑蓝法检测这8例患者分别与其亲缘供者和HLA完全不相合无关第3人之间的混合淋巴细胞增殖反应（MLR）,并计算增殖指数（SI）。结果巢式PCR-SSP方法灵敏度可高达0.001%,并具有较好的特异性。巢式PCR-SSP检测显示,在母子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为40%（6/15）,而在父子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为0。巢式PCR-SSP方法的检测灵敏度与FISH技术相比明显增高,其检测阳性率分别为50%（4/8）和12.5%（1/8）。MLR检测显示,嵌合阳性患者对其亲缘供者和无关第3人外周血单个核细胞（PBMC）的SI分别为（0.949±0.023）、（1.320±0.095）,嵌合阴性患者对其亲缘供者和无关第3人PBMC的SI分别为（1.133±0.036）、（1.245±0.069）;嵌合阳性患者对其亲缘供者PBMC的增殖反应强度与嵌合阴性患者相比明显降低（P=0.001）,并且也显著低于其对无关第3人PBMC的增殖反应强度（P=0.003）。结论巢式PCR-SSP方法灵敏度高、特异性好,适用于临床HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的快速检测。     

AAV2-BPI700-Fcγ1700重组病毒的制备及其转染小鼠后的抗感染作用

目的 通过观测BPI700-Fcγ1 7001嵌合基因导入小鼠对最小致死量E．coli感染攻击的抵抗作用，探讨基因治疗在细菌感染性疾病中应用的可能性。方法采用RT-PCR检测嵌合基因在转录水平的表达；采用免疫组化和酶联免疫吸附实验检测嵌合基因在蛋白水平的表达。结果（1）基因导入小鼠中目的嵌合基因得到表达，在注射部位肌肉组织和血清中可检测到目的嵌合蛋白；（2）在最小致死量E．coli感染攻击后，基因导入小鼠的存活率为31．43％，明显高于对照组小鼠的存活率4．62％；与小剂量头孢呋辛钠联合应用其存活率高达65％。结论BPI700-Fcγ1 700嵌合基因导入小鼠对致死量E．coli感染具有较好抵抗作用，提示抗感染基因治疗在细菌感染性疾病，特别是在感染高危人群中具有广阔的临床应用前景。     

急诊腹腔镜治疗出血性宫外孕202例临床分析

目的探讨急诊腹腔镜治疗出血性宫外孕的可能性、优越性。方法回顾分析1998年8月~2005年10月急诊腹腔镜出血性宫外孕402例,随机分为腹腔镜组202例,开腹组200例。比较两组手术时间、并发症、术后病率、术后输卵管通畅情况。结果腹腔镜比开腹手术住院时间短、术后恢复快、并发症少、术后病率少。手术时间,腹腔镜组(1998年8月~2001年12月)比开腹手术组长,(2002年1月~2005年10月)短于开腹组,结论腹腔镜手术应用于急腹症出血性宫外孕,当休克早期,在抗休克的同时行腹腔镜手术较安全、有效,病人术后恢复快、不增加并发症,更适应有生育要求患者。     

肠腔静脉人工血管C型分流术的远期疗效观察

目的 探讨肠腔静脉C型分流术治疗食管胃底静脉曲张破裂出血的远期疗效。方法 对成阳市中心医院肝胆外科1992年以来施行的36例肠腔静脉C型分流术的临床资料进行总结分析。结果 36例患者术后门静脉压平均下降1．51kPa，胃镜检查食管静脉曲张均有明显减轻或消失。术后再出血率5．6％，肝性脑病发生率8_3％，术后1年、3年、5年及10年的生存率分别为97．2％、93．3％、89．3％及66．7％。结论肠腔静脉C型分流术手术适应证广，操作简单，近、远期疗效满意，适于推广。     

重组Rab8截短体蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

目的 获得Rab8纯化蛋白,制备多克隆抗体,为深入研究Rab8在病毒感染宿主细胞过程中的作用奠定基础.方法 首先从HepG2细胞中克隆Rab基因,然后从Rab8质粒中亚克隆Rab8 C端编码122个氨基酸的基因片段,构建Rab8与6His的融合蛋白原核表达质粒.原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备Rab8多克隆抗体.采用ELISA法检测其效价.Western检验抗体特异性,间接免疫荧光染色法验证其免疫组化特性.结果 克隆了人Rab8编码基因,构建了表达Rab8 C端编码122个氨基酸的原核表达质粒pQE31-Rab8-122,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子量约15 000的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠后收获抗血清.ELISA显示抗体效价达1/20 000.Western blot和免疫荧光染色结果显示此多克隆抗体能够与原核表达的Rab8蛋白发生特异性反应,并能够识别HepG2细胞中内源性Rab8蛋白.结论 本研究获得原核表达的Rab8纯化蛋白,成功的制备了Rab8多克隆抗体,为进一步研究Rab8参与病毒感染宿主细胞提供了重要的实验材料.     

生长抑制因子1基因核定位序列-绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建p33^ING1b核定位序列（nuclear locating sequence，NLS）-绿荧光蛋白融合表达载体，将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC-5，建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型。方法应用逆转录PCR获得p33^ING1b的NLS序列，然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，再用此载体转染MRC-5细胞系，观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，由该载体表达的绿荧光蛋白-NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位，而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白，绿色荧光信号定位于细胞浆中。结论在活细胞内，生理情况下p33^ING1b完全定位于细胞核，并且在其亚细胞定位的转运过程中，NLS肽段起着决定性作用。     

四川省蚋亚属一新种（双翅目：蚋科）

本文记述四川省峨眉山蚋属Simulium蚋亚属Simulium一新种，以中国科学院院士胡经甫命名为经甫蚋S．（S．）jinfful sp．nov．该蚋与S．（S．）himalayense Purl，1930，S．（S．）taiwanicum Takaoka，1979．S．（S．）shanxlense Cai and An，2003，S．（S．）immortalls Cai and An，2003，S．（S．）chamlongi Takaoka and Suzuki，1984相似，但是，雌虫的生殖叉突具内突和外突，肛上板椭圆形，前腿基节、转节、股节棕黄色；生殖腹板板体短，其长约为顶端宽度的0．8倍，与上述蚋种明显不同。模式标本保存在北京军事医学科学院医学昆虫标本馆。     

A second locus (GLC3B) for primary congenital glaucoma (Buphthalmos) maps to the 1p36 region

Primary congenital glaucoma (gene symbol: GLC3) is an ocular disorder that occurs for 0.01-0.04% of blind people. In the majority of familial cases reported so far, this condition is inherited as an autosomal recessive trait. We have recently used a group of 17 GLC3 families with a minimum of two affected offspring and consanguinity in most of the parental generation and mapped the first GLC3 locus (GLC3A) to the 2p21 region. Six families did not show any linkage to the GLC3A locus and thus provided evidence for genetic heterogeneity of this disorder. A total of eight families unlinked to the 2p21 region were used to search for the chromosomal location of the second GLC3 locus. Herein, we describe mapping of a new locus (designated GLC3B) for primary congenital glaucoma to the short arm of chromosome 1 (1p36.2-36.1) that is situated centromeric to the neuroblastoma and Charcot-Marie-Tooth type 2A (CMT2A) loci. A total of 17 DNA markers were genotyped from this region of chromosome 1. Four families showed no recombination with the two markers D1S2834 and D1S402 with a maximum lod score of 4.510 and 4.157 respectively. Pairwise and multipoint linkage analysis and inspection of the haplotypes revealed that the remaining four families are not linked to this part of chromosome 1, thus providing further evidence that at least one more locus for the autosomal recessive form of GLC3 must exist in the genome. Based on the recombination events, the overall linkage map of this region is: tel-D1S1192-D1S1635-D1S1193 - (D1S1597/-D1S489/D1S228)- [GLC3B/D1S2834/D1S402] - (D1S1176/D1S507/D1S407) - D1S2728-(MFAP2/D1S170) - D1S1368 - D1S436- D1S1592-cen.