疏水层析法和凝胶过滤法分离HI47抗CD20 F(ab'''')2之比较

目的　比较疏水层析和凝胶过滤两种方法分离纯化HI4 7抗CD2 0F(ab’) 2 的优缺点。方法　采用亲和层析柱protein G对发酵菌体裂解液进行粗纯化,分别采用疏水层析法和凝胶过滤法进行抗CD2 0F(ab’) 2 的分离纯化:疏水层析采用梯度洗脱,80 %B液洗脱2 0min ,10 0 %B液洗脱30min ;凝胶过滤以5 0mmol LPB缓冲液(pH 7.0 ) ,0 .8mL min洗脱4h。结果　粗纯化产物主要含F(ab’) 2 、Fab’,含量分别为19.6 %、5 9.7%。采用疏水层析法1h即可完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 7% ,纯度为89.3% ;凝胶过滤4h完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 5 % ,纯度为90 .5 %。FACS结果表明,两者结合Raji细胞的阳性率分别为99.93%和99.97%。结论　疏水层析分离纯化抗CD2 0F(ab’) 2 简单、快速、回收率高、纯度高,适用于大规模的工业化生产。     

NBS法标记抗CD20F(ab')2条件的研究

目的 :探讨NBS法标记抗CD2 0F(ab’) 2 的最优条件。方法 :其它条件固定时 ,依次改变反应时间、NBS用量、反应温度、反应体积 ,进行标记后将反应混合物经PD - 1 0柱淋洗 ,收集蛋白峰 ,测定放射性计数 ,计算标记率和免疫活性分数。结果 :反应时间在 2min之前 ,标记率随时间延长而提高 ,2min后出现平台 ,3min达最大值 ,活性在 3min之前变化不大 ,之后明显降低 ;NBS/F(ab’) 2 在 1 6时标记率最高 ,1 4之后活性急剧下降 ;温度对标记率和活性的影响不明显 ;小体积反应有利于提高标记率。结论 :反应时间为 3min ,NBS/F(ab’) 2 为1 6 ,室温小体积标记为最优条件     

体外心肺复苏在成人难治性院内心脏骤停中的应用

目的总结体外心肺复苏(ECPR)技术用于成人院内心脏骤停(IHCA)患者抢救性循环辅助治疗的临床经验。 方法总结分析2012年7月至2017年12月间于首都医科大学附属北京安贞医院住院的74例成人IHCA患者进行ECPR辅助患者临床资料,按照是否存活出院分为出院存活组(SG组,n＝23)和住院死亡组(DG组,n＝51),通过多元回归来分析影响患者临床预后的高危风险因素。 结果存活出院患者,神经系统功能良好(脑功能分级为CPC 1～2级)。与SG组患者相比较,DG组患者接受ECPR辅助前的平均年龄较高、血气pH值较低和细胞外剩余碱较低,差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。体外膜氧合(ECMO)辅助期间DG组患者肾脏功能衰竭需接受持续肾脏替代治疗和严重神经系统并发症的发生率均较高,差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。多元回归分析结果提示高龄(年龄≥65岁)、肾脏功能衰竭需要持续肾脏替代治疗和严重神经系统并发症是影响IHCA患者住院死亡的独立高危风险因素。 结论ECMO能够为成人IHCA患者提供有效循环辅助,挽救部分患者生命。     

靶向4-1BBL 和CD3 双信号的协同抗肿瘤作用机制研究*

目的:探讨人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白增强抗CD3/抗CD20diabody介导的靶向杀伤作用及其机制。方法:通过表达纯化人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白及抗CD3/抗CD20diabody,利用台盼蓝计数观察联合应用人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白及抗CD3/抗CD20diabody对淋巴细胞增殖的影响;采用ELISA 检测白介素-2（IL- 2）水平。RT-PCR 检测穿孔素和颗粒酶mRNA 的表达。Calcein 检测其联合应用抗CD3/抗CD20双功能抗体及PBL 对靶细胞Raji 细胞的杀伤作用。结果:人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白增强抗CD3/抗CD20diabody对靶细胞Raji 细胞的杀伤作用,其机制可能是促进淋巴细胞增殖,减少细胞死亡,促进IL- 2 分泌及上调穿孔素和颗粒酶mRNA 表达。结论:人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白与抗CD3/抗CD20diabody联合应用,分别靶向4-1BBL 和CD3 双信号发挥协同抗肿瘤作用,为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。      

重组融合蛋白抗CD20Fab-LDM的构建、表达及体外活性研究

目的构建和表达抗CD20Fab-LDP(力达霉素辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM(力达霉素),并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot鉴定纯化产物;采用FACS方法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用冷乙二醇法制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM;采用MTT法鉴定抗CD20Fab-LDM对CD20+Raji细胞特异性的细胞毒作用。结果DNA序列测定结果表明抗CD20Fab-LDP融合蛋白已构建成功,可溶性表达产物的产量可达4mg.L-1以上,具有与Raji细胞(CD20+)结合的活性,与抗CD20Fab的亲合常数相当,抗CD20Fab-LDM体外能特异性杀伤Raji细胞,IC50值为0.9×10-10mol.L-1。结论成功地构建了抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并获得可溶性高效表达,表达产物具有与相应靶抗原结合的活性,并成功制备了抗CD20Fab-LDM强化融合蛋白,体外能特异性杀伤CD20+的Raji细胞。     

抗人乳腺癌细胞膜表面角蛋白CK8的单克隆抗体的制备及鉴定

目的：建立针对多药耐药人乳腺癌细胞膜表面差异抗原的抗体库,并鉴定抗角蛋白CK8特异性的单克隆抗体。方法：采用细胞免疫和杂交瘤技术制备单克隆抗体库,经免疫沉淀得到抗原-抗体复合物,SDS-PAGE分离目的抗原,质谱测序,Western blot验证及激光共聚焦显微镜观察抗原分子的细胞膜定位。结果：成功筛选到稳定分泌抗CK8分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株（7F9）。结论：文中所研制的单克隆抗体具有与乳腺癌细胞膜表面CK8分子特异结合的活性,在上皮来源肿瘤标志物CK8的临床检测及CK8相关生物学活性研究中具有广泛应用前景。     

125I标记抗CD20 HI 47 F(ab')2性质研究

目的 :对12 5I标记的抗CD2 0HI 4 7F(ab’) 2 性质进行研究。方法 :采用NBS法进行碘标 ,并测定标记物的标记率、免疫活性分数、放化纯度、亲和常数和体外稳定性。结果 :测定标记率为 87 4 % ,免疫活性分数为 0 4 0 8,放化纯度 >95 % ,亲和常数为 3 2× 10 9M-1,体外 4℃存放 5天 ,放化纯度降低至 0 2 1。结论 :标记物具有较高的放化纯度、免疫活性和稳定性 ,为体内治疗打下良好的基础。     

3-取代芳基氧化吲哚(PH II-7)对肿瘤细胞周期的影响

目的观察3-取代芳基氧化吲哚(PH II-7)对肿瘤细胞周期分布的影响，明确PH II-7的抗敏感肿瘤和耐药肿瘤的共同机制。方法用流式细胞仪检测细胞周期分布，Western印迹分析细胞周期相关蛋白的表达，³H-TdR参入法检测细胞DNA合成，ELISA测定酪氨酸激酶的活性。结果PH II-7对多种肿瘤细胞（包括耐药细胞）的周期分布均有影响，阻滞细胞G₁期至S期的移行，细胞周期相关蛋白CDK2，Rb和c-myc的表达被抑制，Cyclin E的表达升高。PH II-7还可抑制³H-TdR的参入，抑制EGFR的酪氨酸激酶的活性。结论抗耐药肿瘤新药PH II-7是一种细胞周期阻滞剂，可能是通过抑制CDK2而使肿瘤细胞阻滞在G₁期，同时也说明细胞周期阻滞可能是抗耐药肿瘤的新方向。     

抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体的高密度发酵与纯化

在发酵罐上采用高密度发酵的方法对抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体工程菌进行了培养,其发酵结果是每升发酵液的湿菌菌重150 g,OD550值达121;以免疫亲和层析的方法纯化抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体,经计算抗体产量可达146.6 mg/L;间接免疫荧光测定结果经流式细胞仪分析计算表明,抗CD3 ScFV/抗PgP ScFv双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合.