细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。     

大鼠胚胎上胚层干细胞的分离培养研究

目的 获取SD大鼠胚胎中附植后的胚胎上胚层干细胞(EpiSCs),并就影响SD大鼠EpiSCs(SDEpiSCs)分离与培养的组织来源、胎龄、细胞因子等条件进行探讨,从而探索适宜SD大鼠EpiSCs分离培养的实验体系,为下一步SD大鼠EpiSCs的建系提供实验研究基础.方法 以昆明小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,分别取5.5日胎龄的囊胚和7.5日胎龄囊胚上胚层(Epiblast),用添加白血病抑制因子(LIF)或活化素(activin)的基础培养基进行原代培养,分别采用机械法和胰酶消化法对克隆集落进行传代培养.最后通过碱性磷酸酶染色对克隆集落进行鉴定分析,并检测其体外分化能力.结果 培养于LIF培养基和activin培养基中的囊胚均发生严重分化.培养于LIF培养基中的Epiblast也发生了严重的自发分化,而在activin培养基中,Epiblast形成SDEpiSCs原代集落.经机械法传代获得AKP染色阴性、能形成拟胚体的SDEpiSCs.结论 利用细胞因子activin,结合机械传代法可从7.5日胎龄SD大鼠胚胎中获得SDEpiSCs.     

携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。【方法】以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点（MCS）的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪（FACS）观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况、以及对靶细胞生物特性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP。【结论】使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础。     

人和几种常用实验动物胚胎干细胞体外培养的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞,其具有无限增殖、全向分化和嵌合生殖的能力.近年来动物实验受动物来源及动物饲养与实验条件的限制和各国动物保护主义的意识的约束,因此寻找动物实验替代模型已成为各国研究的当务之急.而胚胎干细胞则是实验动物模型的最佳替代模型.使胚胎干细胞能成为实验动物替代模型的首要问题是如何在体外培养出在促进胚胎干细胞增殖的同时,又能维持其未分化二倍体状态的胚胎干细胞.本综述主要陈述人和几种常用实验动物胚胎干细胞的体外培养建系的研究进展.     

内皮素-1引起热痛觉过敏的研究

目的研究内皮素-1(ET-1)在局部引起热痛觉过敏的表现及机制。方法小鼠分为生理盐水对照组(NS组)、ET-1组(ET组)、ETA受体拮抗剂BQ123加ET-1组(BE组),每组6例。NS足底注射生理盐水,ET组足底注射10pmolET-1,BE组注射3nmolBQ12320min后再注射ET-1。测量注药前后15min、30min、45min及60min热痛阈值。结果NS组热痛阈值无明显变化,ET组热痛阈值降低,60min时热痛阈值基本恢复,BE组热痛阈值无明显变化。结论ET-1可在局部通过与ETA受体结合引起动物的热痛觉过敏。     

蛋白激酶C在ET-1引起热痛觉过敏中的作用

目的研究蛋白激酶C(PKC)途径在内皮素-1(ET-1)引起热痛觉过敏中的作用。方法小鼠分为PKC抑制剂BisindolylmaleimideⅠ(BIM)组(BIM组)、ET-1组(ET组)、BIM加ET-1组(BE组),每组6只。BIM组足底注射BIM5nmol15min后再注射PBS,ET-1组注射PBS15min后再注射10pmolET-1,BE组注射5nmolBIM15min后再注射10pmolET-1。测量注药前及注药后15、30、45及60min对热逃避反应时间。结果BIM组与BE组热痛觉阈值无明显变化,ET组热痛觉阈值降低。结论局部注射ET-1通过激活PKC途径从而引起热痛觉过敏。     

新西兰兔对SARS-CoV实验灭活疫苗的体液免疫应答

目的：评价SARS-CoV广东F69分离株实验灭活疫苗的免疫效果。方法：病毒悬液经0．4％甲醛灭活后作为抗原，对新西兰兔进行免疫接种；采用ELISA法和微量细胞中和试验，检测血清特异性IgG抗体和中和抗体的消长规律。结果：初次免疫后第3天，即能检测到抗SARS-CoV特异性抗体，第7天检测到中和抗体。二次免疫后，特异性IgG抗体和中和抗体效价于第6周左右分别达到1：81920和1：20480的峰值水平。继续加强免疫，特异性抗体水平无明显变化。F69分离株与Z2-Y3广东分离株之间能够完全交叉中和。结论：F69毒株实验灭活疫苗具有很强的免疫原性。F69与Z2-Y3毒株之间尽管存在基因序列差异，但能够完全交叉免疫保护。     

包虫疫苗候选抗原基因FABP的克隆与序列分析

目的 获得细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白（FABP）基因序列资料，并进行序列分析。方法 从包虫包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴（protocloex)，提取RNA和DNA，分别以cDNA和基因组DNA为模板扩增出FABP基因；并将其分别克隆到T载体后进行序列测定和分析；同时将从cDNA扩增得到的FABP基因亚克隆到原核表达载体（pTGEX-4T)。结果 获得长度分别为402bp和482bp两个FABP基因，序列分析表明内含子区域在349…427bp，同源性比较结果FABP基因ORF内一个碱基突变。结论 获得了FABP基因，为研究其免疫效果奠定了基础。     

细粒棘球绦虫EG95基因的克隆和序列分析

目的：获得细粒棘球蚴EG395基因序列资料，进行序列分析，为研究包虫病疫苗候选抗原基因奠定基础。方法：从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscoleces)，提取RNA和DNA，用特异引物分别以基因组DNA和cDNA为模板扩增EG95基因；并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析。结果：以基因组为模板获得一个基因。长度为1253bp，以cDNA为模板获得两个基因，长度分别为1121bp和833bp；同源性比较结果表明：来自新疆羊源EG95基因序列和澳大利亚羊源EG395-2基因同源性为98％，有13个碱基变异；从cDNA获得的EG95基因(EG95-like)和DNA来源的EG95相同，只是EG95序列的一部分；从cDNA获得的另一个EG95基因(mEG95)和澳大利亚源EG395-2同源性为99％，有2个碱基不同。分析表明EG95是一个基因家族，可能是虫体发育到六沟蚴阶段特定表达的基因。结论：EG95是一个基因家族，进一步研究该基因家族的结构和功能对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

包虫病诊断抗原的纯化及诊断效价

[目的]建立一种简便快速、适合基层的包虫病诊断方法。[方法]采用简便的一步层析方法从包囊液内纯化具有诊断价值的脂蛋白抗原,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和诊断试纸法(Dipstick法),对血清进行检测,评价其效果。[结果]ELISA检测包虫病人血清48份,阳性45份,检出率93.7％,和10份羊多房棘球蚴血清中的1份起交叉反应,而和羊细颈囊尾蚴、弓形虫、血吸虫血清不起反应。用Dipstick方法检测24份包虫病人血清,19份阳性,检出率79.2％,和其它寄生虫血清无交叉反应。[结论]本试验为包虫病诊断试剂盒的研制奠定了基础。