HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.     

3种G-CSF动员224例外周血干细胞效果比较

目的比较3种粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对外周血干细胞的动员效果。方法我科自体外周血干细胞移植病人224例,采用3种粒细胞集落刺激因子(吉赛欣、欣粒生、惠尔血)进行外周血干细胞动员,对干细胞动员情况、干细胞质量、移植后造血重建和药物毒副作用进行比较。结果224例病人全部移植成功,其动员效果、干细胞质量及在移植后造血重建中的临床效果差异均无显著性,毒副作用小。结论吉赛欣和欣粒生两种国产制剂及惠尔血能可靠用于外周血干细胞动员及造血重建,尤其是国产制剂的价格明显低于进口产品,在有效保证动员效果的同时大大减轻了病员的经济负担,值得临床应用推广。     

Effects of anti-CXCR4 monoclonal antibody 12G5 on proliferation and apoptosis of human acute myelocytic leukemia cell line HL-60

Objective:To investigate the expression of CXCR, on HL-60 cell line and the proliferation, apoptosis of HL-60 cell line cocultured with bone marrow stromal cells, so as to assess the possibility of 12G5. an anti-CXCR4 monoclonal antibody, in eradicating the minimal residual disease. Methods:The activity of SDF-1 was inhibited by 10μg/ml 12G5. After treatment with 12G5. the status of adhesion was observed, and the adhesion rates, apoptosis and cell cycles were detected after 24 h of treatment. Cell growth rates were measured by trypan blue exclusion. Cell growth curve was plotted, and the expression of PCNA and apoptosis related protein including PCNA, Bcl-2 and Fas were detected with immunohis-tochemical technique. Results :(1) There was middling degree expression of CXCR4 on HL-60 membrane. From 0 h to 6 h, as the time of 12G5 incubation along, the expression of CXCR4 decreased gradually. (2) After treatment for 24 h, the adhesion rates in the experiment group and the control were (39. 4±7. 9)% and (51. 4±5. 9)%, respectively. (3)After treatment for 24 h, the percentage of HL-60 cells in G0/G1 phase were (55. 21±4. 9)%, and that in S phase and G2/M phase were (30. 40±4. 1)% and (14. 39±5.2)%, respectively, with the corresponding proportions being (44. 67±2. 2) % , (45. 30±3. 7)% . and (10. 03±2. 6)% in the control. (4) The percentage of apoptotic HL-60 cells was (8. 95±1. 7)% in the experiment group, compared to (3. 97±2. 4)% in the control. (5)The survival rates of HL-60 cells decreased markedly at 48 h to 96 h, and the proliferation slowed down at this time duration. (6)The expression of PCNA and Bcl-2 down-regulated significantly, but the Fas protein expression was up-regulated. Conclusion :12G5 could inhibit the capability of adhesion and proliferation of HL-60 cells and it can induce more cells to enter G0/G1 phase and promote apoptosis. It may be helpful by inhibiting the bioactivity of SDF-1 with 12G5 in the therapy of marrow residual disease.     

裸鼠造血微环境损伤实验动物模型的建立

目的建立适合移植实验使用的裸鼠造血微环境损伤动物模型。方法分别用3．5Gy、5Gy、6．5Gy、8Gy4个^60Coγ辐射剂量照射裸鼠，检测经过辐照后各组裸鼠1、3、5、7、14、21d血象变化，检测辐射后1、7、14、21d裸鼠骨髓基质CFU—F形成情况，用流式细胞仪检测辐射后1、7、14、21d骨髓基质细胞VCAM-1的表达。结果8．0Gy辐射剂量裸鼠死亡率100%；3．5Gy、5Gy、6．5Gy辐射剂量组裸鼠的造血损伤均能在辐射后21天之内自我恢复；6．5Gy组骨髓CFU—F于移植后7d（22±6）、14d（33±6）较3．5Gy、5Gy组均具有显著降低（P〈0．01），VCAM-1表达于7d（21．67±7．45）、14d（22．33±9．07）、21d（23．33±4．51）较对照组显著降低（P〈0．01）、较3．5Gy组差异有显著性（P〈0．05），21d（23．33±4．51）较5Gy组（34．00±4．36）差异有显著性（P〈0．05）。结论6．5Gy是裸鼠造血微环境损伤实验动物模型的适宜辐射剂量。     

造血干细胞移植患者院外随访的实施及体会

目的提高干细胞移植患者的临床效果和生活质量。方法建立移植后随访观察表和登记制度,采取电话和门诊随访,建立电子文档登记,指导患者后续治疗并监测其病情变化。结果 85.25%的患者坚持了门诊随访,43%的患者接受了用药和临床护理指导。随访患者院外感染发生率较未随访患者低。结论坚持对造血干细胞移植患者出院后的长期规范化随访,有利于患者的后续治疗,可减少移植后相关并发症的发生,同时达到早期发现和控制并发症的目的,提高移植患者的总生存率,改善生活质量。     

SDF-1 cDNA转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究旨在探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）cDNA瞬时转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）前后hBMSCs中SDF-1mRNA表达的情况。在分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体的基础上,通过脂质体介导法将SDF-1真核表达质粒转染至hBMSCs,观测绿色荧光蛋白的表达并用RT-PCR方法检测瞬时转染效率。结果发现：SDF-1-pIRES2-EGFP瞬时转染后hBMSCs的SDF-1mRNA表达增高约20%左右。结论：阳离子脂质体可以将SDF-1cDNA真核表达质粒瞬时转染入hBMSCs,但转染效率低下,不能获得足够数量的稳定转染细胞供后续实验,因此需对转染方法作进一步的探讨。     

自体外周血干细胞移植治疗血液肿瘤206例观察

目的:观察自体外周血干细胞移植(APBSCT)治疗血液恶性肿瘤临床疗效。方法:自2001年3月—2006年12月对206例血液肿瘤患者施行APBSCT,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)40例,急性髓细胞白血病(AML)29例,非何杰金淋巴瘤(NHL)95例,何杰金淋巴瘤(HD)26例,多发性骨髓瘤(MM)16例,观察临床疗效和并发症。结果:除1例ALL外,205例患者移植后造血功能均快速重建。急性淋巴细胞白血病首次完全缓解(ALL-CR1)25例,其中无病存活17例,带病存活2例,死亡6例,急性淋巴细胞白血病再次完全缓解(ALL-CR2)15例,其中无病存活3例,带病存活3例,死亡9例;急性髓细胞白血病首次完全缓解(AML-CR1)17,其中无病存活10例,带病存活2例,死亡5例,急性髓细胞白血病再次完全缓解(AML-CR2)12例,其中无病存活5例,带病存活1例,死亡6例;非何杰金淋巴瘤首次缓解(NHL-CR1)57例,其中无病存活42例,带病存活6例,死亡9例,非何杰金淋巴瘤再次缓解(NHL-CR2)28例,其中无病存活18例,带病存活4例,死亡6例,非何杰金淋巴瘤未缓解(NHL-NR)10例,其中无病存活2例,带病存活3例,死亡5例;何杰金淋巴瘤首次缓解(HD-CR1)8例,其中无病存活8例;何杰金淋巴瘤部分缓解(HD-PR)13例,其中无病存活11例,带病存活2例;RE5例,其中无病存活3例,带病存活1例,死亡1例;MM16例,其中无病存活5例,带病存活4例,死亡7例。结论:APBSCT是一种治疗血液肿瘤安全有效的方法。     

Ad-vcam-1-gfp重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究

本研究探讨血管细胞黏附分子（vcam-1）修饰的人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood derived strom cells，CBDSC）在造血调控中的作用。采用DNA重组技术，将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒；在BJ5183细胞中与pAdeasy—1质粒进行同源重组，产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定。结果表明：vcam-1基因与pAdTrack—CMV载体成功连接，经NotⅠ／XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带，经PCR法扩增后电泳可见1个600bp左右条带，证明pAdTrack—CMV—vcam-1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—vcam-1质粒与pAdeasy—1质粒同源重组后，产物经PACⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb、4kb左右条带，与预期结果相符。腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT—PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达。结论：构建ad—vcam-1-gfP重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高。     

Co^60γ辐照对裸鼠血像及造血微环境功能影响的动态观察

目的探索建立供移植实验使用的裸鼠造血微环境损伤动物模型。方法分别用3．5、5．0、6．5、8．0Gy4个Co^60γ辐照裸鼠，检测经过辐照后各组裸鼠1、3、5、7、14、21d血像变化，检测辐照后1、7、14、21d裸鼠骨髓基质CFU-F形成情况并用流式细胞仪检测辐照后1、7、14、21d骨髓基质细胞血管内皮细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达。结果8．0Gy辐照剂量裸鼠死亡率100％；3．5、5．0、6．5Gy辐照剂量组裸鼠的造血损伤均能在辐照后21d之内自我恢复；6．5Gy组骨髓CFU—F于移植7（22．00±6．00）、14d（33．00±6．00）后较3．5、5．0Gy组均显著降低（P〈0．01），VCAM-1表达于7（21．67±7．45）、14（22．33±9．07）、21d（23．33±4．51）较对照组显著降低（P〈0．01），较3．5Gy组差异有统计学意义（P〈0.05），21d（23．33±4．51）较5．0Gy组（34．00±4．36）差异有统计学意义（P〈0．05）。结论6．5Gy是裸鼠造血微环境损伤实验动物模型的适宜辐照剂量。     

大剂量化疗、自体外周血造血干细胞移植、长间歇维持化疗序贯治疗成人急性淋巴细胞白血病疗效观察

急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种常见的血液系统恶性肿瘤，其治疗包括常规化疗和造血干细胞移植（HSCT）。常规化疗对成人ALL效果较差，据报道其长期生存率只有20％～30％，而且要进行长期维持治疗。2001年3月至2003年8月，我们对我院14例初次诱导治疗缓解的成人ALL患者进行连续3个周期大剂量甲氨蝶呤（Hi—MTX）治疗，之后行自体外周血造血干细胞移植（auto—PBSCT），移植后长间歇常规剂量化疗维持2年，取得了较好的治疗效果。