利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型

目的通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体,转染HSC-T6细胞,获得能稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞,为后期的功能研究提供良好的工具和手段,为临床上治疗肝纤维化提供新策略。方法设计合成COX-2基因特异性的sgRNA(COX-2-sgRNA-1、COX-2-sgRNA-2、COX-2-sgRNA-3),并将其连接至GV371载体上,提取重组后的质粒,将其与包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度。按照MOI值计算病毒最适用量,先将Lenti-Cas9-puro转染至HSC-T6细胞,嘌呤霉素筛选得到HSC-T6-Cas9细胞,再用Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP转染至HSC-T6-Cas9细胞获得HSC-T6-COX-2-/-细胞,通过Cruiser酶切检测及Western Blot等方法在基因和蛋白水平上进行敲除验证。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果通过测序验证COX-2-sgRNA表达载体构建成功。重组表达质粒和包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度均在1×108以上。成功构建能稳定传代的Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞模型。HSC-T6-Cas9细胞中LV-Cas9-Puro mRNA相对表达量(541.93±105.76)高于CON组细胞(1.00±0.02),差异具有统计学意义(t=12.995,P<0.01)。通过Cruiser酶切检测及Western Blot试验,结果提示CRISPR/Cas9慢病毒表达载体能在靶点起作用,其中COX-2-sgRNA-2敲除作用最明显,并且COX-2蛋白表达水平较CON组和NC组相比显著下降(P值均<0.05),提示COX-2-sgRNA有活性。结论成功构建了针对COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒载体,获得稳定的COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-细胞。     

BMSCs肝向分化过程中相关信号通路的研究进展

肝细胞生长因子(HGF)作为一种多效性的细胞调控因子,通过与肝细胞生长因子受体c-Met结合激活下游多种信号路径。HGF对信号路径的激活效果与骨髓干细胞(BMSCs)的分化密切相关。本文综述了HGF对BMSCs向肝细胞诱导分化所涉及信号通路的研究进展,为促进肝脏恢复治疗提供参考。     

甲状腺素对非酒精性脂肪肝大鼠ANGPTL3表达的影响

目的 探讨甲状腺激素(TH)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)表达的影响,明确TH是否通过ANGPTL3途径影响NAFLD大鼠肝脏脂肪变性。方法健康3周初断乳SD雄性大鼠30只,随机分为5组:正常组、高脂组、甲状腺素预防组、甲状腺素治疗组、吉非罗齐组;所有大鼠除正常组外均以高脂饮食喂养,分别于0、4、8、12周断尾取血,12周末处死大鼠,取肝脏。苏木精-伊红法(HE)染色,进行肝脂肪变性程度评分,采用酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测血清ANGPTL3含量,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝脏中ANGPTL3 mRNA的表达水平。结果甲状腺素预防组及吉非罗齐组大鼠肝组织脂肪变性程度均低于高脂组及甲状腺素治疗组(P<0.01)。高脂组血清ANGPTL3水平在第8周后出现增高,呈时间依赖性,其肝组织中的ANGPTL3 mRNA表达亦较正常对照组明显升高(P<0.01)。甲状腺预防组大鼠在8、12周均出现血清ANGPTL3浓度降低,并可下调肝脏ANGPTL3 mRNA水平,与高脂组及甲状腺素治疗组相比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。甲状腺素治疗组与吉非罗齐组亦可一定程度下调血清ANGPTL3水平及肝组织中ANGPTL3 mRNA 表达(P<0.05),但其降低的程度少于甲状腺素预防组(P<0.05)。结论NAFLD形成过程中伴有ANGPTL3进行性增高,早期给予小剂量TH可通过ANGPTL3途径而改善NAFLD大鼠肝脂肪变性程度。     

四株双歧杆菌对高脂饮食大鼠肥胖形成的影响

本研究选用正常人体肠道筛选出的不同双歧杆菌株干预高脂饮食肥胖大鼠模型,为筛选双歧杆菌属中具有较好降脂、减肥效果的菌株提供理论和实验依据.     

舒肝宁注射液治疗酒精性与非酒精性脂肪肝疗效观察

目的观察比较舒肝宁注射液对酒精性脂肪肝与非酒精性脂肪肝的疗效。方法对22名酒精性脂肪肝（AFLD）患者和30名非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者,均给予舒肝宁注射液20 mL,每日1次静脉滴注;对照组18例给予甘利欣注射液150 mg/日。疗程均为4周。检测各组治疗前后血清酶学、血脂等指标。结果两治疗组治疗后的血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHL）水平均比治疗前明显下降（P〈0.01）,且治疗组的改善程度优于对照组（P〈0.01）。酒精性脂肪肝治疗组患者的疗效更为突出,与非酒精性脂肪肝治疗组比较差异有显著性（P〈0.05）。结论舒肝宁注射液治疗脂肪肝,尤其是酒精性脂肪肝安全、有效,且具有一定的降血脂作用。     

甲状腺素及胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝关系研究

脂质代谢异常、氧化应激反应、瘦素、脂联素等与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的发生发展有相互作用,同时也影响着非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发生发展。由此可以推想,甲状腺素与IR和NAFLD有一定的关系。