脂质体介导外源DNA体外转染金黄地鼠卵母细胞的研究

背景与目的:研究外源DNA在金黄地鼠卵母细胞染色体上的整合率,探索卵母细胞作为外源基因载体的可行性.材料与方法:在体外,用脂质体包裹外源NF-Luc质粒,将其与金黄地鼠卵母细胞共培养后收获细胞,分别用斑点杂交、Southern杂交以及荧光原位杂交分析检测Luc 基因在卵母细胞中的整合.结果:Southrn杂交分析,在13个样本DNA中发现9个样本有Luc 基因特异性条带扩增;阳性率为69.2%(48.2%～94.5%),荧光原位杂交分析显示,在253个转染后卵母细胞中发现,2例中期相染色体及3例间期核上有明显的Luc 基因阳性杂交信号.结论:在国内首次证实金黄地鼠卵母细胞可被脂质体包裹的外源DNA转染,即金黄地鼠卵母细胞可以作为外源基因的载体,这一新途径为研究外源基因在金黄地鼠卵母细胞中的表达提供了实验基础.     

外源DNA转染精子的实验研究

背景与目的:探索精子作为外源基因载体的可行性及阳离子脂质体的存在对精子转染率的影响.材料与方法:取性成熟雄性金黄地鼠附睾内精子,采用共培养及脂质体介导两种方法与外源DNA共孵育后,用PCR、Southern blot及荧光原位杂交(FISH)等技术检测外源基因在精子细胞中的存在及存在部位,并对两种方法进行比较分析.结果:金黄地鼠附睾内的活精子具有主动捕获外源基因的能力,荧光原位杂交证明部分外源基因进入了精子头部,脂质体介导组精子外源基因携带率较共培养组高,两组精子用DNA酶处理前后外源基因携带率间差异也有统计学意义,且观察发现死精子经洗涤后没有携带外源基因者.结论:即是在没有脂质体存在的情况下,活的精子细胞仍然能被外源基因所转染,这一过程涉及到精子对外源基因的主动性捕获,脂质体的存在能提高精子外源基因的转染率.     

HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞的研究

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病.为了探索乙肝病毒通过卵母细胞垂直传递的可能性,对HBV DNA重组质粒能否转染小鼠卵母细胞进行了研究.材料与方法:将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA重组质粒进行共培养后,分别提取卵母细胞DNA及制备小鼠卵母细胞中期染色体.用PCR、Southern、斑点杂交及FISH技术证实HBV DNA能否转染小鼠卵母细胞.结果:PCR试验在受检样本中观察到HBV DNA阳性条带.Southern试验在受检PCR产物中观察到明显的阳性杂交信号.用每次实验的最后3次洗液进行斑点杂交未发现HBV DNA阳性信号,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性.荧光原位杂交在1 000个卵母细胞中的36个中期相内发现HBV DNA杂交信号.结论:HBV DNA序列能够通过卵母细胞的透明带和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到卵母细胞染色体上.此类卵母细胞与正常精子受精时,有可能作为载体将HBVDNA带进胚胎.     

预扩增qPCR方法检测少量小鼠早期胚胎细胞中DNA甲基化相关基因的表达

目的: 比较3种实时定量PCR(qPCR)方法对少量小鼠早期胚胎细胞中甲基化相关基因表达水平的检测效果,以期获得适合日常检测的方法。方法: 分别应用常规qPCR方法、基于等温预扩增的qPCR方法、基于PCR预扩增的qPCR方法3种方案对少量小鼠早期胚胎细胞样本中甲基化相关基因TET1、TET2、TET3、DNMT3A的mRNA表达进行检测。结果: 3种方法的灵敏度由高到低依次为基于等温预扩增的qPCR方法、基于PCR预扩增qPCR方法、常规qPCR方法。前两种方法均能在合适的循环数下对少量小鼠胚胎细胞中的多个甲基化相关基因表达进行定量。而基于PCR预扩增的qPCR方法比基于等温预扩增的qPCR方法更经济,适合日常检测。因此,我们选择应用基于PCR预扩增的qPCR方法,检测了小鼠卵细胞以及卵细胞受精后22 h甲基化相关基因表达的变化,结果发现该过程中TET1表达量很低,不易检测到;TET2表达呈降低趋势;TET3和DNMT3A表达显著升高(P<0.01),与文献报道基本一致。结论: 基于等温预扩增的qPCR方法检测少量细胞样品中甲基化相关基因的表达的灵敏度在3种qPCR方法中最高。而基于PCR预扩增的qPCR方法操作简单、灵敏度较高、成本相对低,适合少量细胞样本中多个相关基因表达的实时定量日常检测。     

pEgr-MDA7重组质粒辐射诱导特性的检测

背景与目的：克隆人MDA7 cDNA基因,构建pEgr-MDA7重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中经辐射诱导后mRNA水平。材料与方法：从人外周血mRNA中克隆人MDA7 cDNA基因,连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr- MDA7重组质粒,利用脂质体介导转染人EC9706细胞,用定量PCR方法检测不同剂量X射线照射后被转染细胞中MDA7的mRNA水平。结果：测序结果证实MDA7 cDNA基因序列正确,酶切鉴定证实pEgr-MDA7重组质粒构建正确。被pEgr- MDA7重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量X射线照射后,MDA7基因mRNA水平均高于未照射组。结论：X射线可诱导pEgr- MDA7重组质粒在人EC9706细胞中表达增强。     

丹参诱导人骨髓间充质细胞体外向神经细胞分化的研究

骨髓间充质细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）是骨髓细胞中除去造血干细胞（非黏附细胞）之外的黏附细胞部分，具有多向分化的潜能，属于多能干细胞。一定条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。最近的研究表明，BMSC在一定的条件下可分化为神经细胞。它对自体神经细胞移植有潜在的应用前景，本文作者应用丹参对其进行研究。     

表遗传学--一门正在迅速崛起的学科

一、问题提出 "虎生虎,凤生凤,老鼠生仔会打洞",这是大家所熟识的遗传现象.可是公驴母马生成骡,公马母驴生駃騠,两者相差竟如此之大;从同一胚胎干细胞克隆出来的两只羊,遗传组成虽相同,大小却悬殊.同样,克隆的小鼠也有一大一小之别,相差近一倍;两窝小鼠,一窝母鼠会带幼鼠,一窝母鼠却无此本能,让其幼鼠散落四处,等等.动物有各种奇特的遗传现象,植物也不例外.     

重组小鼠Izumo的表达及其特异性抗体对小鼠体外精卵融合的影响

背景与目的:精子膜蛋白Izumo在精卵融合中起关键作用.本研究旨在表达和纯化重组小鼠Izumo蛋白(mIzumo),探讨重组mIzumo在小鼠体内的免疫原性及其特异性抗体对小鼠体外精卵融合的影响.材料与方法:将编码mIzumo蛋白的cDNA序列亚克隆到pET28a(+)原核表达载体上,构建pET28a(+)-mIzumo重组质粒.在BL21(DE3)大肠杆菌中表达重组6His-mIzumo融合蛋白,并通过Ni2+亲和层析纯化.使用福氏佐剂乳化纯化的6His-mIzumo,分别免疫雌性和雄性C57BL/6小鼠,并采集免疫前和免疫后血清.用Western Blot和ELISA检测血清中抗6His-mIzumoIgG抗体的特异性和滴度.采用IVF和精卵融合试验检测血清中抗6His-mIzumo抗体对小鼠精卵融合的影响.结果:纯化的6His-mIzumo在SDS-PAGE凝胶上显示为约60 kD的单一条带.免疫了重组蛋白的雌性和雄性小鼠都产生了抗6His-mIzumoIgG抗体.抗6His-mIzumoIgG抗体与重组蛋白,小鼠睾丸、附睾及精子膜蛋白存在交叉反应,免疫印迹显示为约60kD的特异性条带.ELISA结果表明,免疫6His-mIzumo后至少6周之内,血清中的抗6His-mIzumoIgG抗体维持在最高水平.免疫后血清处理组的小鼠精子与去透明带卵母细胞发生胞膜融合的能力明显低于免疫前血清处理组(P＜0.01).结论:纯化的6His-mIzumo融合蛋白能够诱发雌性和雄性小鼠产生可阻断精卵融合发生的特异性血清抗体.因此,6His-mIzumo可作为同种异体抗原用于免疫避孕候选疫苗的研究.     

HIV感染者服用抗病毒药后生精异常分析

发现1例HIV感染者在服用抗病毒药过程中出现一过性的无精子症,分析发现此现象是在用依非韦仑代替奈韦拉平之后,认为依非韦仑可能是导致HIV感染者一过性无精子症的主要原因。目前尚未见抗病毒药对男性生殖副作用的报道。此结果提示,HIV患者服用抗病毒药特别是依非韦仑过程中需监测精液质量。     

一种稳定的人卵母细胞体外培养成熟技术

背景与目的：建立一种稳定的人卵母细胞体外培养成熟技术。材料与方法：取术后部分卵巢组织,穿刺卵泡获得未成熟卵母细胞,在含激素的培养基中培养24～36 h。结果：经培养的人卵母细胞合符成熟的判断标准：①含有第一极体;②胞浆匀称,色浅,颗粒均匀。结论：该方法稳定,提示未成熟人卵母细胞经体外培养成熟在人类辅助生殖领域具有广泛的应用前景。