辐射与化疗诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究

目的 探讨辐照与阿霉素诱导早期生长反应因子(Egr-1)启动子调控造血生长因子基因表达对造血损伤的恢复作用.方法 构建携带Egr-1启动子且下游连接GM-CSF和EGFP基因的真核表达载体(Egr-EG);脂质体介导转染人骨髓基质细胞系HFCL;经60Co γ源辐照2.5 Gy或3μmol/L的阿霉素处理后,采用FACS检测转染细胞绿色荧光蛋白的表达,N-乙酰半胱氨酸(活性氧抑制剂)鉴定辐照及阿霉素处理诱导Egr-1调控下游基因表达的特异性;采用ELISA和RT-PCR检测辐照或阿霉素对HFCL/EG细胞GM-CSF蛋白及mRNA表达的影响;观察辐照及阿霉素处理后的细胞上清对CFU-GM形成的影响.结果 在辐照和阿霉素处理的HFCL/EG细胞中均显示EGFP和GM-CSF表达较未处理组明显增强(t=5.11,P<0.01),未处理组EGFP+细胞占1.2%,阿霉素组EGFP+细胞占15.2%,辐照组EGFP+细胞占18.2%;N-乙酰半胱氨酸明显减少辐照和阿霉素处理后细胞的绿色荧光蛋白表达强度,两组间差异无统计学意义(P0.05);辐照和阿霉素处理组细胞上清促进CFU-GM增殖作用较未处理组明显增强(t=4.37,P<0.01).结论 辐照和阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达可能对其所致的造血损伤具有一定的恢复作用.     

阻断己糖激酶-Ⅱ基因表达对结肠癌化疗的影响及其机制

目的：观察阻断己糖激酶-Ⅱ（ＨＫ-Ⅱ）基因表达对结肠癌ＬｏＶｏ细胞化疗敏感性的影响及其机制。方法：应用质粒介导的短发夹ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）真核表达法特异性阻断ＨＫ-Ⅱ基因表达。通过半定量逆转录 聚合酶链反应（ＲＴ-ＰＣＲ）和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析ＲＮＡ干扰效应。ＭＴＴ法检测氟尿嘧啶（５-ＦＵ）和奥沙利铂（Ｌ-ＯＨＰ）对ＬｏＶｏ细胞的半数抑制浓度（ＩＣ５０）;底物比色法测定半胱氨酸蛋白水解酶（ｃａｓｐａｓｅ）-３活性;Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测胸苷酸合成酶（ＴＳ）表达变化。结果：ＲＮＡ干扰技术特异性下调结肠癌ＬｏＶｏ细胞ＨＫ-Ⅱ基因表达,ｍＲＮＡ和蛋白质水平的表达抑制率分别为７２.１％和７１.２％。阻断ＨＫ-Ⅱ基因表达后,结肠癌ＬｏＶｏ细胞５-ＦＵ和Ｌ-ＯＨＰ的ＩＣ５０值分别为（４.７０±０.４０）μｇ／ｍｌ和（６.２７±０.５９）μｇ／ｍｌ,均明显低于正常培养细胞的（１１.９３±０.１５）μｇ／ｍｌ和（９.７７±０.６０）μｇ／ｍｌ（Ｐ＜０.０１）;与正常培养细胞相比,ＲＮＡ干扰的ＬｏＶｏ细胞ｃａｓｐａｓｅ-３活性明显增高,ＴＳ蛋白表达下降。结论：阻断ＨＫ-Ⅱ基因表达可能通过活化ｃａｓｐａｓｅ-３和降低ＴＳ表达的途径来增加结肠癌ＬｏＶｏ细胞化疗敏感性。     

结肠癌组织ＮＲＰ２的表达与淋巴结转移的关系

目的：探讨结肠癌组织中ＮＲＰ２的表达在淋巴管生成和转移中的作用。方法：采用免疫组化法、ＲＴ-ＰＣＲ法检测结肠癌组织中ＮＲＰ２和ＶＥＧＦ-Ｃ的表达,以及结肠癌组织淋巴管的免疫组化标记和微淋巴管密度（ＭＬＤ）计数。结果：结肠癌组织周围区域（４８.８±２３.５）、表浅区域（２４.６±１０.１）和肿瘤中心（１１.３±７.７）ＭＬＤ存在显著差异（Ｐ＜００５）;结肠癌组织ＮＲＰ２的ｍＲＮＡ水平为０.８７±０.２６,高于正常组织０３８±０.１２,转移组的ｍＲＮＡ水平为１１２±０２５,也高于非转移组的０.７６±０.１９（Ｐ＜０.０１）。ＮＲＰ２表达定位于结肠癌细胞浆和部分淋巴管内皮细胞浆,阳性率为３４.８％;其表达与肿瘤边缘及标记部位ＭＬＤ呈正相关（ｒ＝０.４３２,Ｐ＜０.０１）,并与肿瘤的淋巴结转移、分化程度、Ｄｕｋｅｓ分期和浸润深度相关（Ｐ＜０.０５）,与ＶＥＧＦ-Ｃ的表达亦呈正相关（ｒ＝０.６０６,Ｐ＝０.００１）。结论：ＮＲＰ２表达可能对结肠癌局部淋巴管生成及淋巴结转移起到重要的作用。     

小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的：建立一种体外分离，培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法，探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点，为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础，方法：分离5－6周龄的小鼠胫骨，股骨，用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后12－16d形成意志贴壁的成纤维状细胞，体外多向诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线的测定，观察其接种贴壁率，检测细胞周期和超微结构。结果：体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力；MSCs倍增时间约为38h，传代后12h贴壁达90％以上，细胞周期显示有80％细胞处于G0／G1期，并用电镜照片显示其超微结构。结论：在本实验条件下，体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点，可望用于自体创伤促愈。     

辐射与化疗诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究

目的 探讨辐照与阿霉素诱导早期生长反应因子(Egr-1)启动子调控造血生长因子基因表达对造血损伤的恢复作用.方法 构建携带Egr-1启动子且下游连接GM-CSF和EGFP基因的真核表达载体(Egr-EG);脂质体介导转染人骨髓基质细胞系HFCL;经60Co γ源辐照2.5 Gy或3μmol/L的阿霉素处理后,采用FACS检测转染细胞绿色荧光蛋白的表达,N-乙酰半胱氨酸(活性氧抑制剂)鉴定辐照及阿霉素处理诱导Egr-1调控下游基因表达的特异性;采用ELISA和RT-PCR检测辐照或阿霉素对HFCL/EG细胞GM-CSF蛋白及mRNA表达的影响;观察辐照及阿霉素处理后的细胞上清对CFU-GM形成的影响.结果 在辐照和阿霉素处理的HFCL/EG细胞中均显示EGFP和GM-CSF表达较未处理组明显增强(t=5.11,P<0.01),未处理组EGFP+细胞占1.2%,阿霉素组EGFP+细胞占15.2%,辐照组EGFP+细胞占18.2%;N-乙酰半胱氨酸明显减少辐照和阿霉素处理后细胞的绿色荧光蛋白表达强度,两组间差异无统计学意义(P0.05);辐照和阿霉素处理组细胞上清促进CFU-GM增殖作用较未处理组明显增强(t=4.37,P<0.01).结论 辐照和阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达可能对其所致的造血损伤具有一定的恢复作用.     

ＮＲＰ２表达抑制对结肠癌细胞ＬｏＶｏ移植瘤淋巴管生成和转移的影响

目的：探讨抑制Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎｓ-２（ＮＲＰ２）基因表达对结肠癌淋巴管生成和转移的影响。方法：采用ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）下调结肠癌ＬｏＶｏ细胞株ＮＲＰ２表达,接种ＮＲＰ２ＲＮＡｉ的ＬｏＶｏ细胞株于裸鼠,建立裸鼠结肠癌结肠原位移植瘤模型, 分别观察移植后４、６、８和１２周裸鼠结肠原位移植瘤淋巴管生成以及转移的情况。结果：成功建立结肠癌裸鼠原位移植瘤动物模型。下调结肠癌ＬｏＶｏ细胞株ＮＲＰ２表达能显著降低裸鼠结肠原位移植瘤的淋巴管密度以及远处转移。结论：抑制ＮＲＰ２表达可以抑制结肠癌的淋巴管生成和转移,它将是一个潜在的肿瘤治疗靶点。     

大肠腺瘤及其癌变微卫星不稳定性与细胞增殖的研究

目的:探讨微卫星不稳定性(MSI)在大肠腺瘤癌发生中的意义及其对大肠腺瘤、腺瘤癌变组织细胞增殖活性的影响。方法:采用聚合酶链反应-简单序列长度多态性(PCR-SSLP)及免疫组化EnvisionTM方法,对36例大肠腺瘤及12例腺瘤癌变的MSI和增殖细胞核抗原(PCNA和Ki-67)表达进行检测。结果:大肠腺瘤及其癌变组织MSI总阳性率18.75%(9/48),其中,两个位点以上7例阳性,阳性率为15.58%(7/48);一个位点2例阳性。MSI阳性大肠腺瘤及其癌变的PCNA和Ki-67标记指数显著低于MSI阴性者(P<0.05)。结论:MSI可能是结直肠癌发生的早期分子改变,MSI阳性结直肠癌细胞增殖活性较低。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

60Coγ射线照射后培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB的变化

目的 探讨辐射对培养小鼠骨髓基质细胞内ＮＦ－ｋＢ的影响。方法 采用免疫组化、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ及凝胶电泳迁移率实验。结果 免疫组化方法显示正常胃髓基质细胞细胞核的周围表达低水平的ＮＦ－ｋＢ,８．０Ｇｙ＾６０Ｃｏγ射线损伤后１ｈ即见其表达较正常显著升高并出现明显的核移位,４ｈ达高峰,６ｈ有所回落,８ｈ恢复正常;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示照射后骨髓基质细胞ＮＦ－ｋＢ的蛋白表达量较正常明显升高,     

用泛端粒PNA和全染色体特异DNA探针联合FISH检测人淋巴细胞完全和不完全染色体互换

人们已经观察到辐射诱导的染色体畸变中有明显的不完全易位存在。由于一些易位片段太小,可能不会被荧光原位杂交(FISH)的全染色体染色所检测到,因此,研究了用泛端粒肽核酸(PNA)探针和全染色体DNA特异探针的联合FISH检测辐射诱导的人淋巴细胞完全和不完全染色体互换。方法:培养人淋巴细胞52h后,用氚β射线对细胞进行0.9Gy的低剂量照射,剂量率为0.019Gy/h。在中期用RNA酶处理,然后用乙酸和甲醇(1∶3)固定30min,接着用KCl、蛋白酶K处理,4%的多聚甲醛固定10min。变性后,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的端粒PNA探针杂交1.5h,再用对1、2…