糖皮质激素受体αsiRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建糖皮质激素受体α(GRα)小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并检测其抑制结肠癌细胞株Lovo中糖皮质激素受体α表达的效果.方法 根据基因文库中GRα的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别插入到pGenesil-1质粒中,并对重组质粒(命名为pGenesil-1/GRα1和pGenesil-1/GRα2)进行测序鉴定.脂质体介导下转染Lovo细胞株,RT-PCR和Western Blot检测转染后GRα的表达.结果 成功构建GRαsiRNA 真核表达载体(pGenesil-1/GRα1和pGenesil-1/GRα2);pGenesil-1/GRα2转染(脂质体法)Lovo细胞后,RT-PCR和Western blot检测细胞内GRα的表达显著降低.结论 GRαsiRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究GR在结肠癌化疗中的作用奠定了重要的实验基础.     

间充质干细胞经MyoD转染诱导为成肌细胞后对肌损伤的修复作用

目的 观察间充质干细胞(MSCs)被MyoD转染诱导为成肌细胞后对肌损伤的修复作用并探讨其机制.方法 160只SCID小鼠随机分为正常组、致伤对照组、MSCs组和成肌细胞组,每组40只.将真核表达双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD转染MSCs,使MSCs分化诱导为成肌细胞,将MSCs和成肌细胞分别植入Cardiotoxin造成的小鼠损伤肌组织中,1、2、4、6周后观察肌损伤修复效果.结果 成功制作了肌损伤模型,MSCs和成肌细胞对肌损伤均有促进修复作用,以成肌细胞效果显著,成肌细胞组肌肉组织抗牵引力强于MSCs组.Western blotting结果表明,修复过程中成肌细胞组MyoD表达显著高于MSCs组、损伤对照组和正常组,成肌细胞组1周时JNKl、ERK2表达显著增加,p38表达显著减少,但6周时与正常组比较均无显著差异.结论 MSCs被MyoD转染诱导后形成的成肌细胞能有效修复肌损伤,JNKl、p38及ERK2在修复中起重要作用.     

原位免疫疗法联合化学疗法治疗晚期恶性黑色素瘤临床研究

目的探讨半抗原二硝基氟苯(DNP)原位免疫疗法联合化疗与单纯化疗治疗恶性黑色素瘤的治疗效果。方法选取120例Ⅲ期或Ⅳ期恶性黑色素瘤(恶黑)患者,随机分为两组,试验组60例患者采用半抗原DNP原位免疫疗法联合化疗治疗;对照组60例采用单纯以DTIC、DDP为主的化疗,比较两组患者治疗的客观有效率、临床获益率和无进展生存期。结果两组患者均接受5～6个周期的化疗,实验组无进展生存期(18.8±7.9)个月优于对照组的(13.4±5.3)个月,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),试验组的客观反应率、临床获益率均高于对照组。结论半抗原DNP原位免疫疗法联合化疗可有效增强晚期恶性黑色素瘤患者治疗的有效率,延长患者生存时间。     

骨髓间质干细胞与细胞替代治疗

骨髓中除了有造血干细胞以外，还存在一种骨髓间质干细胞。它既有骨髓基质细胞的祖细胞，也可以作为骨、软骨、肺、肌肉和神经等组织的祖细胞。研究发现，它在体外培增时间为33小时，表型不均一，具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点；而且与组织工种相结合它在促骨折愈合、肌腱和韧带组织工程修复、神经系统细胞替代治疗和基因治疗以及造血重建等实验中展现出了良好的应用前景。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及部分生物学特性的实验研究

目的 建立一种体外分离和培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法，并探讨其部分生物学特性。方法 无菌条件下抽取正常健康人骨髓3-5ml，经密度梯度离心得到单个核细胞，接种入含10％胎牛血清的IMDM培养液，测定其生长曲线，并观察其贴壁率、细胞周期和超微结构变化。结果 培养的MSCs3-4h开始贴壁，贴壁率为60％-80％，2-3d即可见集落形成，14d左右融合90％以上，基本上为梭形成纤维细胞状形态，流式细胞检测显示有70．03％的细胞处于G0/G1期，电镜观察表现出早期细胞的特点。结论 成功地建立了一种分离培养人骨髓MSCs的方法，获得的细胞形态单一、生长稳定、增殖较快，为进一步应用MSCs促进创伤修复提供了实验基础。     

辐射与化疗诱导Egr-1启动子调控GM-CSF基因表达的实验研究

目的 探讨辐照与阿霉素诱导早期生长反应因子(Egr-1)启动子调控造血生长因子基因表达对造血损伤的恢复作用.方法 构建携带Egr-1启动子且下游连接GM-CSF和EGFP基因的真核表达载体(Egr-EG);脂质体介导转染人骨髓基质细胞系HFCL;经60Co γ源辐照2.5 Gy或3μmol/L的阿霉素处理后,采用FACS检测转染细胞绿色荧光蛋白的表达,N-乙酰半胱氨酸(活性氧抑制剂)鉴定辐照及阿霉素处理诱导Egr-1调控下游基因表达的特异性;采用ELISA和RT-PCR检测辐照或阿霉素对HFCL/EG细胞GM-CSF蛋白及mRNA表达的影响;观察辐照及阿霉素处理后的细胞上清对CFU-GM形成的影响.结果 在辐照和阿霉素处理的HFCL/EG细胞中均显示EGFP和GM-CSF表达较未处理组明显增强(t=5.11,P<0.01),未处理组EGFP+细胞占1.2%,阿霉素组EGFP+细胞占15.2%,辐照组EGFP+细胞占18.2%;N-乙酰半胱氨酸明显减少辐照和阿霉素处理后细胞的绿色荧光蛋白表达强度,两组间差异无统计学意义(P0.05);辐照和阿霉素处理组细胞上清促进CFU-GM增殖作用较未处理组明显增强(t=4.37,P<0.01).结论 辐照和阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达可能对其所致的造血损伤具有一定的恢复作用.     

脑脊液置换治疗原发性蛛网膜下腔出血38例

我院1997年1月至2001年12月共收治原发性蛛网膜下腔出血(SAH)38例,采用脑脊液置换疗法取得较好的疗效。现报道如下:     

Cardiotoxin肌损伤模型的形态学观察

目的 建立由Cardiotoxin所致的肌损伤模型并了解损伤部位自然修复的情况，为研究肌损伤的再生及修复作用奠定基础。方法 将Cardiotoxin按8μg／g体质量局部注入SCID小鼠股四头肌中，分别观察不同时相点(24h、7d、2周、4周和6周)损伤部位的病理改变。结果 注射24h后可见肌细胞变性坏死，胞浆内有空泡形成；7d后肌纤维发生明显断裂，变性坏死加重，并出现钙化；2周后变性坏死钙化加重达到顶峰；4周后变性坏死钙化依然存在，但已可见部分肌纤维再生；6周后变性坏死已不明显，钙化仍存在，肌细胞大部分再生。结论 成功地建立了Cardiotoxin所致的肌损伤模型，该模型稳定、简便、易控制，且重复性好。     

地塞米松影响结肠癌细胞对奥沙利铂与氟脲嘧啶化疗敏感性的实验研究*

目的:检测糖皮质激素受体在结肠癌组织及细胞株中的表达,探讨地塞米松共处理或预处理24h,结肠癌细胞株对奥沙利铂和氟脲嘧啶化疗敏感性的变化。方法:采用免疫组化检测糖皮质激素受体在61例结肠癌组织标本及4 种结肠癌细胞株中的表达;Hoechst33342 染色、流式细胞仪检测体外地塞米松对结肠癌细胞株的凋亡诱导作用;以MTT 法检测地塞米松共处理或预处理24h 后,结肠癌Lovo 细胞株对奥沙利铂和氟脲嘧啶化疗敏感性的变化。结果:在57.3% 的结肠癌组织标本中糖皮质激素受体呈阳性表达,在四种结肠癌细胞株中仅Lovo 和HCT-116表达糖皮质激素受体,HT- 29和SW- 480 细胞不表达。单独应用地塞米松后,对糖皮质激素受体阳性的Lovo 和HCT-116 细胞有较强的促凋亡作用,对不表达糖皮质激素受体的HT- 29和SW- 480 细胞作用则不明显。以1 ×10-4 mol/L的地塞米松处理Lovo 细胞24h,或与奥沙利铂共处理可使奥沙利铂的 IC 50从（13.7 ± 1.3）μ g/mL 降低至（5.9 ± 0.6）μ g/mL 和（4.8 ± 0.7）μ g/mL;同样处理可使氟脲嘧啶的IC 50从（72.2 ± 8.1）μ g/mL 降低至（21.1 ± 4.1）μ g/mL 和（18.6 ± 4.0）μ g/mL。结论:部分结肠癌组织及细胞株表达糖皮质激素受体。地塞米松体外作用能够促进糖皮质激素受体阳性的结肠癌细胞发生凋亡,与奥沙利铂和氟脲嘧啶预处理或共处理后可以增加结肠癌细胞的化疗敏感性。      

糖皮质激素受体β表达与结肠癌细胞激素敏感相关性的实验观察

目的:观察结肠癌组织糖皮质激素受体表达及地塞米松(dexamethasone,Dex)体外对结肠癌细胞的作用,探讨糖皮质激素受体β(GRβ)亚型表达在结肠癌细胞激素反应中的作用。方法:免疫组化检测GR在结肠癌组织和细胞株中的表达,MTT和annexinⅤ-FITC/PI双染检测糖皮质激素对结肠癌细胞的作用,RT-PCR检测糖皮质激素作用过程中GRα和GRβ的mRNA表达变化,si RNA沉默GRβ的表达对细胞激素敏感性的影响。结果:在57.3%的结肠癌组织标本中糖皮质激素受体呈阳性表达,在四种结肠癌细胞株中只有LoVo和HCT116表达糖皮质激素受体,HT29和SW480细胞不表达。在体外实验中地塞米松对糖皮质激素受体阳性的LoVo和HCT116细胞有较强的增殖抑制和促凋亡作用;在Dex作用过程中GRα和GRβ表达均升高,但是GRβ升高更明显;转染GRβ的小分子干扰片断后,Lo-Vo细胞GRβ的mRNA表达下降67.3%,Dex诱导的细胞凋亡率则从(34.7±1.8)%上升至(45.4±4.3)%(P<0.05)。结论:糖皮质激素对结肠癌细胞有增殖抑制和凋亡诱导作用,细胞GRβ表达增加抑制结肠癌细胞对糖皮质激...