刚地弓形虫入侵细胞过程中细胞骨架和Ca2+ 浓度变化

目的 探讨弓形虫入侵不同类型细胞过程中胞内游离Ca²⁺ 浓度及细胞骨架的变化。 方法 常规方法制备刚地弓形虫RH株速殖子悬液，分别感染吞噬性细胞（小鼠单核巨噬样细胞J774A.1）和非吞噬性细胞（人脐静脉内皮细胞HUVEC）。光学显微镜观察弓形虫感染情况及细胞骨架抑制剂秋水仙素、松胞菌素D对感染率的影响。用荧光显微镜观察弓形虫速殖子入侵J774A.1、HUVEC过程中细胞微丝和微管变化。用激光共聚焦显微镜检测弓形虫速殖子入侵过程中宿主细胞游离Ca²⁺ 浓度变化。 结果 正常J774A.1胞内游离Ca²⁺ 浓度为102.0%±6.2%。弓形虫感染后 2 min游离Ca²⁺ 浓度升高，测得荧光强度为 305.2%±21.5%，感染后30～40 min最高荧光强度为1219.7%±58.4%，显著高于基础值（P<0.01）。而经磷脂酶C抑制剂U73122预处理的J774A.1，Ca²⁺ 浓度无明显变化(P>0.05）；虫体入侵过程中J774A.1微丝结构发生凝集。微丝结构抑制剂松胞菌素D（P<0.01）和微管结构抑制剂秋水仙素（P<0.05）均可明显降低弓形虫感染率。弓形虫入侵HUVEC过程中Ca²⁺ 浓度变化不明显（P>0.05），宿主细胞微丝、微管结构亦无明显变化。松胞菌素D和秋水仙素对弓形虫入侵HUVEC的能力影响均较小(P>0.05）。 结论 弓形虫入侵吞噬性细胞J774A.1过程中胞内游离Ca²⁺ 浓度显著升高，细胞骨架微丝结构发生凝聚，而入侵非吞噬性细胞HUVEC过程中胞内游离Ca²⁺ 浓度和细胞骨架均无明显变化。     

问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定

目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。     

问号钩端螺旋体属lipL32/1-ompL1/1融合基因的真核表达及其表达产物的免疫反应性

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)的融合基因lipL32/1-ompL1/1真核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性.方法:采用连接引物PCR构建融合基因lipL32/1-ompL1/1,克隆测序后构建lipL32/1-ompL1/1的毕赤酵母真核表达系统pPIC9K-lipL32/1-ompL1/1-P.pastorisGS115.用MM和MD平板分离His Mut 型菌落,YPD平板筛选出G418高抗性的His Mut 转化子.以酵母裂解酶处理的高拷贝转化子His Mut 克隆裂解产物为模板,5'AOX1和3'AOX1为引物,用PCR检测所构建的毕赤酵母工程菌株染色体DNA中的目的融合基因.在BMMY培养基中用甲醇诱导目的重组蛋白rLipL32/1-rOmpL1/1表达.采用硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析提纯培养物上清液中的rLipL32/1-rOmpL1/1.采用SDS-PAGE和Western blot分别检测rLipL32/1-rOmpL1/1的产量及其免疫反应性.结果:获得的lipL32/1-ompL1/1融合基因约为1 794 bp.其核苷酸和氨基酸序列与原始lipL32/1和ompL1/1基因型比较,相似性分别高达99.94%和100%.所构建的真核表达系统可分泌rLipL32/1-rOmpL1/1,SDS-PAGE后位于预期位置处,产量约占上清总蛋白的40%.rLipL32/1和rOmpL1/1兔抗血清均能与表达的rLipL32/1-rOmpL1/1结合.结论:本研究成功地构建了钩体lipL32/1-ompL1/1融合基因高效毕赤酵母真核表达系统,所表达的融合蛋白具有特异的免疫反应性,可作为研制钩体新疫苗的候选抗原.     

牙龈卟啉单胞菌菌毛相关外膜蛋白pgmA基因的克隆和表达

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)pgmA基因,构建pgmA基因表达载体,鉴定其表达产物的免疫性.方法:采用高保真PCR分别从牙龈卟啉菌ATCC 33277和47A-1菌株中扩增pgmA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的pgmA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用兔抗融合蛋白血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,采用ELISA 检测65株临床分离牙龈卟啉单胞菌与PgmA融合蛋白抗血清的反应情况.结果:所克隆的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277与47A-1菌株pgmA基因的核苷酸序列同源性为100%,与报道的相应核苷酸序列同源性为98.98%,氨基酸序列同源性高达99.18%.pET32a-pgmA-BL21DE3系统的PgmA融合蛋白表达量为细菌总蛋白的50%左右.PgmA融合蛋白免疫家兔能获得相应抗体并与PgmA蛋白发生结合反应.ELISA结果证实92.3%的牙龈卟啉菌临床菌株(60/65)能与PgmA融合蛋白抗血清发生结合反应.结论:本研究成功地构建了Pg pgmA高效表达系统,所表达的PgmA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Pg检测试剂盒和Pg疫苗的候选抗原.     

幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）ureB基因并构建其原核表达系统。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增ureB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的ureB表达载体，在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果：所克隆的ureB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.88％-97.82％，氨基酸序列同源性高达99.65％-99.82％。pET32a-ureB-BL21DE3系统的UreB融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40％左右。UreB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp ureB高效表达系统，所表达的UreB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为Hp瘤苗的抗原。     

牙周炎患者龈下厌氧菌群的分离和鉴定

从24例正常人、34例成年人牙周炎和18例青少年牙周炎患者龈下分离和鉴定了23种共296株革兰氏阴性无芽胞厌氧菌。产黑色素类杆菌、牙龈类杆菌、伴放线嗜血杆菌、核梭杆菌、衣氏和梅氏放线菌是牙周炎患者龈下优势厌氧菌群。两类患者龈下韦荣氏球菌的检出率与正常人相似。实验结果还提示,牙周炎非为单一的病原体所引起,而是多种厌氧菌共同作用的结果。     

芩连合剂对幽门螺杆菌相关性慢性胃溃疡治疗作用的机理研究

目的:探讨芩连合剂对幽门螺杆菌延缓乙酸性胃溃疡愈合的治疗作用及其作用机制.方法:采用幽门螺杆菌(Hp)多次重复感染乙酸性胃溃疡大鼠,造成Hp相关的慢性胃溃疡模型,运用免疫组化和原位杂交等技术观察该方对Hp感染的慢性胃溃疡大鼠胃黏膜碱性成纤维生长因子(bFGF)mRNA和胃黏膜细胞增殖核抗原(PCNA)的影响.结果:中药组与Hp 乙酸组相比溃疡底部及周围胞浆中bFGFmRNA表达明显增强,并能显著提高胃黏膜PCNA标记指数的阳性率.结论:芩连合剂能有效拮抗NCTC11637株Hp对慢性胃溃疡的延缓愈合,其加速溃疡愈合的主要机理与促进溃疡周围bFGF表达和促进胃黏膜细胞增殖等有关.     

比较牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导THP-1和HL-60细胞分泌IL-1β能力及相关信号通路受体的差异

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis,Pg-LPS)诱导人单核巨噬细胞株THP-1和人粒细胞白血病细胞株HL-60分泌白介素-1β(interleukin,IL-1β)能力差异,并了解其相关Toll样受体.方法 采用酚水法提取牙龈卟啉单胞菌ATCC33277株脂多糖(Pg-LPS).采用ELISA试剂盒定量检测Pg-LPS作用的THP-1和HL-60细胞分泌IL-1β水平.采用TLR2或TLR4抗体阻断试验联合ELISA检测.了解Pg LPS结合不同靶细胞上Toll样受体的类型.实验中采用大肠杆菌脂多糖(E-LPS)作为Pg-LPS对照.结果 1μg/ml Pg-LPS作用6 h或1μg/ml E-LPS作用24h,THP-1细胞分泌的IL-1β水平明显升高(P<0.01).但Pg-LPS和E-LPS诱生的细胞因子最高浓度相近(P>0.05).而1μg/ml Pg-LPS作用24h或1μg/ml E-LPS分别作用48h,HL-60细胞分泌的IL-1β水平明显升高(P<0.01),且Pg-LPS诱生的最高浓度明显高于E-LPS(P<0.05),但HL-60细胞分泌的上述胞因子最高浓度均明显低于THP-1细胞(P<0.01);TLR2和TLR4抗体均可有效阻断Pg-LPS诱导THP-1细胞分泌IL-1β的活性(P<0.05),但仅发现TLR2抗体可阻断Pg-LPS诱导HL-60细胞分泌IL-1β的活性(P<0.05).E-LPS诱导THP-1细胞或HL-60细胞分泌IL-1β的活性仅可被TLR4抗体所阻断(P<0.05).结论 Pg-LPS诱导THP-1和HL-60细胞分泌IL-1β高于E-LPS.TLR2和/或TLR4作为Pg-LPS受体取决于细胞种类.     

急性脑出血患者糖代谢变化分析

目的观察急性脑出血患者的糖代谢变化情况。方法选择我院2006年1月～2009年11月收治的557例急性脑出血住院患者,采集一般资料、病史及临床表现。有糖尿病史者入院后测空腹血糖和餐后2 h血糖（2-hPG）;无糖尿病史者于发病1周病情稳定后行标准75 g葡萄糖耐量试验（OGTT）,以判断糖代谢情况。结果 557例脑出血中正常糖耐量189例（33.90%）,糖代谢异常368例（66.1%）,其中糖尿病185例（33.2%）,糖调节受损183例（32.9%）。不行OGTT仅依据空腹血糖检测则有89.1%（163/183）的糖调节受损和14.1%的（26/185）糖尿病被漏诊。结论脑出血患者大多合并糖代谢异常,通过OGTT可及时发现,有利于制订合理的治疗方案,提高生存率,改善预后。