骨骼肌分化与外源基因表达

骨骼肌分化与外源基因表达首都医科大学北京神经科学研究所田竟生郑少鹏徐群渊骨骼肌为终末型分化细胞，是机体内最长的细胞，近年来发现，骨骼肌中的成肌细胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）做为基因治疗的靶细胞（又称运载细胞）具有很大优势。成肌细胞寿命长，可较长期表达外源目...     

MRI对于恒河猴PD模型建立和治疗的评价

目的：应用MRI评价建立恒河猴帕金森病（PD）模型，以及在中脑黑质受损区进行细胞移植的疗效。材料与方法：选取6只恒河猴，雌性2只，雄性4只，体重6．0－8．5kg。经颈总动脉注射甲基－苯基－四氢吡啶（MPTP）建立PD模型，并行MRI模型。获取横断和冠状位T1WI和T2WI，以单侧注射MPTP的对侧脑组织作为正常对照。建立PD模型后，再对病例中脑黑质区进行细胞移植，并复查MRI。最后应用抗酪氨酸羟化酶免疫组化和Grino染色对猴脑组织切片进行病理检查。结果：MRI的T2WI显示注射MPTP侧中脑黑质缩小，内部有局灶性高信号。细胞移植前后的MPRI所见无显著性差异。免疫组化检查证实注射MPTP侧中脑多巴胺能神经元明显减少，Grino染色显示注射侧黑质内大量胶质细胞增生。经细胞移植症状缓解的猴脑切片显示神经元的减少无明显改变。结论：MRI是恒河猴PD模型建立的一种评价手段，可以用于细胞移植疗效的评价。     

侧脑室外侧壁室管膜下区的细胞成分及结构观察——巢蛋白能否作为神经干细胞特异性标记物

目的：观察利用巢蛋白标记侧脑室外侧壁室管膜下区域不同类型细胞的成分及其结构。方法：实验于2004-09／12在首都医科大学神经科学研究所完成。观察3只正常成年雄性SD大鼠侧脑室外侧壁室管膜下区的细胞组成情况，对组织切片进行内氏染色以及胶质源纤维酸性蛋白，多唾液酸神经细胞黏附分子和巢蛋白免疫组织化学染色并进行内氏复染。结果：3只大鼠均进入结果分析。在内氏染色切片上，侧脑室外侧壁室管膜下区由深染和浅染细胞组成，深染细胞呈多唾液酸神经细胞黏附分子阳性，而浅染细胞呈胶质源纤维酸性蛋白阳性，深染和浅染细胞均可呈巢蛋白阳性。另外，侧脑室壁上靠近管腔的单层细胞也呈巢蛋白阳性。结论：在大鼠侧脑室外侧壁室管膜下区，成神经细胞和星型胶质细胞均可表达巢蛋白，侧脑室壁上的室管膜细胞也能表达巢蛋白。说明在成年动物脑内，单独的巢蛋白不能作为标记神经干细胞的特异性标记物。     

脑力智宝对乳鼠脑皮质神经细胞和PC12细胞生长发育的影响

目的：从细胞学角度研究脑力智宝在维持神经元存活和促进神经突起生长方面的保护作用。方法：将SD大鼠分为脑力智宝提取物高剂量组(0．63g／L)、低剂量组(0．04g／L)和对照组，连续给药7次后眼球取血制备含药血清，用MTT法检测脑力智宝对原代培养神经细胞生长发育的影响；用分散培养法培养PCI2细胞，测定加入不同浓度脑力智宝提取物(0．63和0．04g／L)、脑力智宝含药血清(6和3g／kg)、神经生长因子后PC12细胞在24，48和72h的突起阳性细胞百分比。结果：脑力智宝对PC12细胞具有营养作用。使细胞突起增加增长。阳性细胞数增多，48h时0．63g／L脑力智宝提取物可使阳性细胞百分数从模型组的17．2％提高到38．4％(t=4．89，P&;lt;0．01)，3g／kg脑力智宝含药血清可使阳性细胞百分数达到69．0％(t=9．37，P&;lt;0．01)，并可促进原代培养鼠脑皮质神经细胞的生长发育，MTT法检测A值明显增加，尤以0．63g／L脑力智宝提取物(t=4．79，P&;lt;0．01)和3g／kg脑力智宝(P&;lt;0．01，t=8．81)组作用明显。0．63g／L脑力智宝提取物可显著促进PCI2细胞增殖，在2，4和6d时分别可使PC12细胞数目较对照组分别增加1．56，1．85和2．96倍，差异均有显著性意义(t=2．67，5．27，3．12；P&;lt;0．05-0．01)，均与对照组比较有显著性差异；6g／kg含药血清组亦显著增加。脑力智宝提取物和含药血清均可促进无血清培养神经细胞轴突生长，对原代培养的神经细胞均具有促进生长作用，使突起阳性细胞数增加。结论：脑力智宝具有促进乳鼠脑皮质神经细胞和PC12细胞生长发育的作用。     

6-羟多巴胺单侧损伤大鼠黑质纹状通路后多巴胺受体的长时程变化

目的:应用免疫组织化学和蛋白印迹方法来观察帕金森病模型大鼠D1和D2多巴胺受体(64周)的长时程变化。方法:实验于2003-10/2005-03在首都医科大学北京神经科学研究所、北京市神经再生修复研究重点实验室完成。①选择SD雌性大鼠78只,随机分为模型组72只和正常组6只。造模后2,4,8,16,32,64周进行实验,每个时间点取6只模型大鼠用于免疫组织化学染色,另外6只模型大鼠和1只正常大鼠用于进行Westernblotting分析。②观察模型大鼠黑质和纹状体多巴胺D1受体和多巴胺D2受体免疫组织化学染色强度。③Westernblotting用来测定模型大鼠相对于正常大鼠纹状体多巴胺D1受体和多巴胺D2受体蛋白含量。结果:78只大鼠均进入结果分析。①损伤2周后模型大鼠损伤侧纹状体的多巴胺1型受体免疫反应在2周和4周要弱于损伤对侧,8周及以后损伤侧纹状体内多巴胺1型受体免疫反应与损伤对侧没有显著性差异。损伤侧黑质的多巴胺1型受体阳性强度一直要弱于损伤对侧约20%,多巴胺1型受体阳性面积也小于损伤对侧。而纹状体内多巴胺2型受体的免疫反应则刚好相反,即损伤侧则强于健侧,从2周就开始上升约15%,到16周上升到顶峰(约30%),之后下降,于64周时下降到约5%。损伤侧黑质的多巴胺2型受体与酪氨酸羟化酶染色相似,几乎为阴性。②多巴胺D2受体在损伤侧纹状体从2周时开始上调,到16周达到高峰后回落,直到64周仍高于正常水平。与多巴胺D2受体相反,多巴胺D1受体在损伤侧纹状体于2周和4周下调,到8周以后恢复到正常水平。同时,多巴胺D1受体免疫反应强度在损伤侧黑质表达持续减弱且阳性面积也减小。结论:帕金森病在纹状体失去多巴胺能神经支配后多巴胺D2受体上调,多巴胺D1受体先下调后恢复正常水平。     

钙调素在生长相关蛋白-43调控细胞周期中的作用

目的 探讨钙调素-43（CaM）在生长相关蛋白（-43）（GAP-43）调控细胞周期过程中的作用。方法 利用反转录病毒体系构建表达不同活性状态的GAP-43（即野生型、非磷酸化型和假磷酸化型GAP-43）NIH3T3细胞模型,并分别命名为表达野生型GAP-43（3T3-G）、 表达非磷酸化GAP-43（3T3-A）和表达假磷酸化GAP-43（3T3-D）;另设对照组（转染空载体NIH3T3细胞）。通过免疫组织化学及Western blotting鉴定各型细胞模型转入GAP-43的情况;应用免疫共沉淀检测各型GAP-43与CaM的功能关系;应用细胞生长曲线、BrdU累积标记法、BrdU脉冲标记法测定各型转GAP-43细胞的细胞周期。结果 免疫组织化学和Western blotting结果显示,NIH3T3细胞能够表达转入的各型GAP-43。其中,3T3-A 细胞增殖速度较其他细胞减缓。免疫共沉淀显示,3T3-A中有GAP-43 和CaM相互作用表现;3T3-G中GAP-43 和CaM有少量相互作用;3T3-D与3T3-P中则相互作用。累积BrdU测定,脉冲BrdU测定M期的实验表明,3T3-P细胞无明显周期改变;3T3-D与3T3-G细胞的周期延长;3T3-A细胞的周期明显延长并显示G1期明显延长。结论 表达GAP-43的细胞其增殖表现可能是由于GAP-43结合了CaM,使之与Ca²⁺的结合减少而引起细胞周期（尤其是G1期）的延长。     

与Sertoli细胞共培养大鼠大脑皮质神经前体细胞分化中Notch信号相关基因表达分析

目的:检测与Sertoli细胞共培养条件下大鼠大脑皮质神经前体细胞分化过程中Notch信号相关分子的表达变化.方法:分离大鼠Sertoli细胞和大脑皮质神经前体细胞.神经前体细胞与Dertoli细胞共培养条件下,用Real-time PCR相对定量法,分别检测Notch受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及其配体Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2,以及ngn1、hes1基因的表达变化.结果:培养细胞汇片后第5天,Sertoli细胞Notch1～4基本表达维持不变;其配体Jagged2表达较高,但不表达Delta1;同时也不表达ngn1、hes1.神经前体细胞Notch表达水平较高,尤以Notch1和Notch2为高;而其配体以Jagged1、Jagged2表达较高,前神经因子Hes1有较高表达,而Ngn1表达较低.细胞共培养条件下,Notch受体、配体以及Hes1与神经前体细胞组相比都有明显的下调,而Ngn1却相对有所提高.结论:Sertoli细胞可通过Notch配体的作用,调节神经前体细胞Notch信号分子的表达.在共培养条件下,Sertoli细胞对神经前体细胞Hes1表达有抑制作用,但对Ngn1有正向调节作用,从而影响神经前体细胞的分化.     

rAAV2-EM>hGAD/EM>65重组载体的构建和功能检测

目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能。方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65)。包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度。体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ氨基丁酸(GABA)的含量。在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量。结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10¹¹/ml。组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L。STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g。结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体。AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能。在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量。     

骨髓干细胞来源的星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成

目的探讨骨髓干细胞来源的星形胶质细胞是否参与脑损伤后胶质界膜的形成。方法将制作好的雌性Sprague-Dawley大鼠脑损伤模型24h后经尾静脉植入GFP标记的雄性Sprague-Dawley大鼠的骨髓源干细胞。在植入后2、4和8周取脑,用GFAP荧光免疫组织化学方法显示星形胶质细胞,GFP显示骨髓来源细胞,观察损伤组织边缘的胶质界膜中是否存在GFP/GFAP双阳性细胞。结果在损伤组织边缘可见骨髓干细胞来源的星形胶质细胞。结论骨髓干细胞来源星形胶质细胞参与脑损伤后胶质界膜的形成。这对脑外伤的恢复和组织工程材料的植入有重要的意义。     

人酪氨酸羟化酶催化核心DNA片段的克隆与表达

获得编码人酪氨酸羟化酶催化核心ｃＤＮＡ片段,并观察其表达。方法采用人的全长ＴＨｃＤＮＡ为模板,设计特定的引物进行ＰＣＲ扩增反就并构建真核表达载体－质粒ｐＣＭＶＴＨｃ。在对目的片段测序后,将重组质粒转染到大鼠原代培养骨骼肌细胞内,用免疫组织化学方法检测其表达。