Her2／neu基因定量检测方法的建立

目的 建立人Her2/neu基因mRNA荧光定量检测方法 ,评价该方法 的准确性及稳定性.方法 基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆栽体pGEM-T-Her2/neu作为定量模板,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,以建立实时荧光定量RT-PCR方法;并且在GeneAmp 5700型检测议上测定10例经免疫组织化学法证实Her2/neu表达卅的乳腺癌组织标本,同时对最大值及最小值重复测量.结果 Her2/neu动态检测范围为103～107拷贝/μg RNA(r≥0.996),内参β-actin的动态检测范围为103～108拷贝/μg RNA(r>0.998).10例检测癌组织的Her2/neu表达范围为6.6×104～4.7×106拷贝/μg,最大值10次重复测量值为(4.65±0.55)×106>拷贝/μg,最小值10次重复测量值为(7.36±0.75)×104拷贝/μg.结论 成功建立人Her2/neu基因表达RT-PCR检测方法 ,具有较高的准确性和稳定性,可用于检测Her2/neu基因表达水平,为进一步应用于乳腺癌预后判断及术后治疗方案的选择奠定了基础.     

κ、λ轻链C区基因的克隆与表达

目的 利用pBAd／gⅢA表达载体和大肠杆菌Top 10克隆和表达κ、λ轻链C区基因片段，探索生物工程技术制备小分子抗原的可行性。方法 经RT-PCR从正常人的外周血淋巴细胞mRNA中扩增出κ、λ轻链恒定区基因，限制性双酶切后分别克隆到同样酶切的pBAd／gⅢA质粒中，转化大肠杆菌。酶切鉴定与PCR法筛选出阳性克隆菌株，经Arabinose诱导表达出κ、λ轻链片段。Ni^2 -NTA亲和层析纯化后，以150mg/mL SDS-PAGE与Westem blot鉴定纯化产物，并测定蛋白的相对浓度。结果 SDS-PAGE与Westem blot结果显示，纯化后的产物在Mt 16000处呈致密的单一条带，与克隆基因表达产物的相对分子质量一致，该带经HRP标记的羊抗人IgG Fab抗体证实为抗体片段成分。结论 κ、λ轻链C区基因的pBAd／gⅢA表达在技术上是可行的，该原核系统表达的片段具抗原性，为后续的开发应用打下了基础。     

颗粒溶素重组表达载体的构建和原核表达

目的：构建人颗粒溶素（Granulysin,GNLY）基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,构建重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实,成功地构建了GN-LY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量（Mr）同预期值相一致。结论：成功构建了重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,并在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。     

诱导型环氧合酶在人冠状动脉粥样硬化组织中的表达分布

为探讨诱导型环氧合酶在人冠状动脉不同动脉粥样硬化病变类型间的分布。收集 15例尸检的人冠状动脉共 4 5个标本 ,根据HE染色病理特征及AHA标准分为 3组 ,其中正常冠状动脉对照 3个 ;纤维斑块或Ⅴ型病变(稳定斑块 )标本 2 2个 ;粥样硬化斑块伴有不同程度炎症反应的复合斑块或Ⅵ型病变 (不稳定斑块 )冠状动脉标本2 0个。分别采用免疫组织化学染色和逆转录聚合酶链反应方法 ,检测诱导型环氧合酶蛋白和mRNA在以上不同类型标本中的分布表达。结果发现 ,诱导型环氧合酶主要表达分布于动脉粥样硬化组织斑块区 ,在复合斑块中诱导型环氧合酶的表达明显高于纤维斑块 (诱导型环氧合酶灰度值 14 7.0± 1.1比 5 6 .2± 4 .4 ,P <0 .0 1) ,而在非斑块区和正常冠状动脉中均未检测到诱导型环氧合酶的表达。结果提示 ,诱导型环氧合酶参与了动脉粥样硬化病理发生以及斑块稳定性中炎性反应的调控过程 ,抑制斑块局部诱导型环氧合酶的高表达 ,有望成为治疗动脉粥样硬化及稳定斑块的重要靶点     

游离与总前列腺特异性抗原及其比值对前列腺癌鉴别的临床意义

目的了解总前列腺特异性抗原 (T- PSA,总 - PSA)、游离前列腺特异性抗原 (F- PSA,游离 - PSA)以及 F-PSA和 T- PSA比值 (F- PSA/ T- PSA,F/ T) ,对良性前列腺增生 (BPH )和前列腺癌患者的鉴别价值。方法采用微粒子酶免疫技术 ,测定 BPH和前列腺癌患者的血清 T- PSA、F- PSA,并计算 F/ T比值。结果 12 3例 BPH者的 T-PSA为 (6 .5± 3.1)μg/ L ,小于 4μg/ L占 6 6 .7% ;F- PSA为 (1.38± 1.18)μg/ L ,小于 0 .93μg/ L占 6 3.4% ;F/ T为(2 1.2± 3.3) %。 5 9例前列腺癌患者的 T- PSA为 (36 .41± 2 2 .17)μg/ L ,大于 4μg/ L的占 93.2 % ;F- PSA为 (2 .2 6± 2 .18)μg/ L大于 0 .93μg/ L的占 76 % ;F/ T为 (11.9± 4.4) %。统计上 F/ T比值显著低于 BPH组。 T- PSA在 4～ 10μg/ L时 ,F/ T比值差异更明显。结论以 T- PSA 4μg/ L、F- PSA 0 .93μg/ L为临界值有意义 ;对 T- PSA在 4～ 10μg/ L时 ,结合应用 F/ T比值有利于对低 T- PSA的前列腺癌患者及早作出鉴别     

β2—微球蛋白在恶性实体瘤诊断中的价值

目的探讨血清 β2 -微球蛋白 (β2 - M)对恶性实体瘤的诊断意义　方法放射免疫法 (RIA)测定 36例正常对照组和 190例各类恶性实体瘤患者的血清 β2 - M,并对结果进行统计分析。结果正常对照组血清 β2 - M为 (1.89± 0 .47) mg/ L,癌肿组为 (3.32± 0 .84) mg/ L,两者比较差异有显著性。以血清 β2 - M≥ 2 .9mg/ L 为阳性判断标准 ,癌肿组平均阳性率为 6 5 .8% ,肝癌、胰腺癌的阳性率最高 ,为 78.6 %和 77.8% ;乳腺癌阳性率最低 ,为 47.4%。结论血清 β2 - M对恶性实体瘤的诊断有一定价值 ,联合其他肿瘤标志物能提高检出阳性率 ,但要排除非肿瘤因素的干扰     

B细胞激活因子水平ELISA检测方法的建立及临床初评

目的:建立血清B细胞激活因子(Blymphocyte stimulator,BlyS)水平的ELISA检测方法,并初步探讨其临床价值.方法:以商品化的抗人BlyS单克隆抗体、生物素化抗人BlyS多克隆抗体,采用双抗夹心法自行建立BlyS血清水平的ELISA检测方法;并对80例风湿性疾病患者[50例系统性红斑狼疮(SLE)、20例类风湿关节炎(RA)、10例干燥综合征(SS)]、60例自身免疫性肝病患者[35例原发性胆汁性肝硬化(PBC)、25例自身免疫性肝炎(AIH)]和40例正常人的血清BlyS水平进行检测.结果:成功建立血清BlyS水平的ELISA检测法且重复性较好,80例风湿性疾病患者的血清BlyS水平为(8.23±1.42)ng/ml,60例自身免疫性肝病患者为(3.40±0.79)ng/ml,40例正常人的血清BlyS水平为(3.19±0.88)ng/ml.与正常人相比,风湿性疾病组的BlyS血清水平明显升高(P＜0.01),而自身免疫性肝病组的BlyS血清水平升高则不明显.结论:本研究所建立的BlyS血清水平ELISA检测方法简便、可靠、准确,为后续研究BlyS与自身免疫性疾病尤其是风湿性疾病的关系奠定了基础.     

人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白制备和纯化

目的:用生物发酵方法大量制备含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌,用金属亲和层析方法纯化大肠杆菌表达产物,获得大量高纯度的人源抗HBS-Fab-IFN-α融合蛋白。方法:选取含重组质粒pBAD/HBs-Fab-IFN-α的Topl0大肠杆菌单克隆菌落,通过制备一级及二级种液,按比例加入5L发酵罐中进行发酵,发酵过程中在菌体起始密度、诱导剂加入时机、诱导时间以及诱导温度等条件探索成熟的基础上,采用50L大型发酵罐进行批量发酵。所获菌体蛋白通过饱和硫酸铵粗提和Ni-NTA金属螯和层析获得较纯的表达产物,比较表达量,鉴定纯化后蛋白的抗原活性及生物学活性。结果:用5L及50L发酵罐能获得较高蛋白产量的大肠杆菌,经饱和硫酸铵粗提及Ni-NTA金属螯和层析纯化后可获得抗原性及生物学活性较好的抗体片段。结论:发酵罐发酵大肠杆菌,产量高,所获蛋白含量活性较稳定,为批量生产作了准备。     

人IgE重链恒定区CH4亚基的克隆、原核表达及纯化

血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上的IgE高亲和力受体(EcεRI)结合则是这些Ⅰ型变态反应的关键步骤[1].很长时间以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过敏性疾病研究的重点.从已有的研究得知,IgE与EcεRI结合的关键部位是其重链恒定区的CH2-CH4,也就是Ige的Fc段,其中3个亚基的作用各有不同[2].本研究利用分子克隆技术,从过敏性个体的外周血淋巴细胞中克隆出中国汉族人IgECH4的cDNA,构建了相应的质粒表达载体,原核表达CH4蛋白,并鉴定其活性,为进一步研究CH4蛋白在lgE与EcεRI结合过程中的作用提供物质基础.