系统性红斑狼疮患者血清B细胞激活因子水平的检测

目的建立检测血清B细胞激活因子(B lym phocyte stim ulator,BlyS)水平的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并检测系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清BlyS水平,初步探讨BlyS与SLE发病机制的关系。方法以商品化的抗人BlyS单克隆抗体、生物素化抗人BlyS多克隆抗体,采用双抗夹心法建立检测BlyS血清水平ELISA方法。对59例SLE确诊患者和40名正常健康献血者的血清BlyS水平、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)浓度、自身抗体[抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)]滴度进行检测,比较SLE患者的血清BlyS水平与免疫球蛋白浓度、自身抗体滴度的相关性。结果59例SLE患者的血清BlyS水平为(8.4±1.6)ng/m l,40名正常人的血清BlyS水平为(3.2±0.9)ng/m l,SLE组的BlyS血清水平明显高于正常人组(P<0.01);且伴随着血清BlyS水平的升高,SLE患者的血清IgG浓度明显升高(r=0.442,P=0.0005);SLE患者的BlyS血清水平与抗dsD NA抗体的滴度也有明显的相关性(r=0.850,P<0.01)。结论本研究所建立的BlyS血清水平ELISA检测方法简便、可靠、准确,为后续研究BlyS与其他自身免疫性疾病的关系奠定了基础。SLE患者的血清BlyS含量是明显升高的,并伴随着血清IgG浓度、抗dsD NA抗体滴度的升高;提示Blys异常表达可能是SLE发病的重要环节,其对自身反应性B细胞的活化、促进特     

人源抗-HBs轻链与干扰素-α融合蛋白的克隆及表达

目的构建人源单克隆抗-HBs Fab片段-IFNα表达载体，对原核表达该融合蛋白的可行性及其效果进行实验研究。方法用聚合酶链反应（PCR）体外扩增目的基因IFN—α，单酶点插入已含人源抗HBs Fab基因的载体，插入点位于轻链基因3’末端，利用酶切、PCR鉴定，测序筛选正确插入的阳性克隆，转化大肠埃希菌Top10．挑选单克隆表达、纯化目的蛋白，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测融合蛋白的抗原性，用Dotblot和WISH细胞检测其生物学活性。结果利用插入了人源抗-HBs Fab段基因及IFN-α基因的pBAD／gⅢA原核表达系统，成功表达了具生物活性的轻链与IFN-α的融合蛋白，其与HBsAg的亲合力与抗-HBs—Fab相近，而且具有干扰素的活性。融合蛋白对HepG2．2．15细胞初步实验结果亦显示出其具有良好的靶向性及致凋亡作用。结论轻链与干扰素IFN—α融合蛋白的成功表达表明，应用原核系统能够同时表达特异抗体和其介导的某些生物活性因子，不失为一种经济、有效的方法，为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了实验依据。     

部分细胞因子基因多态性与自身免疫性肝炎的相关性研究

目的:探讨IL-1、IL-6、IL-10基因多态性与中国人自身免疫性肝炎(AIH)发病的相关性.方法:采用限制性片段长度多态性分析法(RFLP-PCR)和序列特异性引物PCR(SSP-PCR)分析62例AIH患者及160例健康对照外周血单核细胞基因组DNA IL-1( 3953)、IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)、IL-6启动子(-174)、IL-10启动子(-592、-819、-1082)基因多态性,并进行对比分析.结果:在所分析的基因多态性位点中,AIH组的等位基因频率分布与正常对照组均无统计学差异.结论:IL-1B、IL-1RN和IL-6、IL-10启动子基因多态性可能与中国人发生AIH的易感性无关.     

Toll样受体4小干扰RNA表达载体的构建及鉴定筛选

目的构建并筛选到能有效抑制TLR4基因表达的小干扰RNA表达载体,用于研究TLR4基因功能。方法 RNA干扰采用体外构建小干扰RNA表达载体法,将构建好的表达载体转染单核细胞株,分别用流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测TLR4蛋白和mRNA表达变化,筛选抑制效率最高的小干扰RNA表达载体。结果成功构建了TLR4小干扰RNA表达载体,并经电泳及测序证实;编号为S8-1的载体转染入细胞后,TLR4阳性率为27.03%,显著低于对照组的35.12%;流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测均证实编号为S8-1小干扰RNA表达载体的抑制效率最高,可用于后续实验。结论本实验所构建的编号为S8-1小干扰RNA表达载体可有效抑制TLR4基因表达,小干扰RNA表达载体法能够抑制体外培养细胞株TLR4的表达,可用于研究TLR4基因功能。     

生物工程人源抗-HBsFab的抗原特异亲合力简易测定

目的 建立一种简易的抗体亲合力测定技术，对生物工程抗—HBsFab进行抗原特异亲合力测定。方法 应用异种抗体竞争抑制法，在硝酸纤维素膜上进行不同抗原浓度、不同抗体抑制浓度的抗原、抗体反应。酶标记抗Fab抗体(Fabspecific)与相应底物显色，通过抑制效果估测靶抗体的亲合力。结果 ①抗—HBsFab组对不同浓度的抗原皆为阳性且能显示浓度差。②鼠腹水单克隆抗—HBs在10倍于人源抗—HBsFab范围内无抑制作用；多克隆羊抗—HBsAg在10倍于人源抗—HBsFab时显不抑制效应，而在同倍和1／10浓度时无抑制作用。结论 本研究建立的是一种简易、实用的方法，能够达到直观、实际的抗体亲合力检测目的。     

前列腺特异性抗原（PSA）的ABC－ELISA建立和临床初步应用

前列腺特异性抗原是从人精液中提取的一种糖蛋白。血清中ＰＳＡ测定对前列腺良、恶性疾病有重要诊断价值。利用生物素─—抗生物素系统与ＥＬＩＳＡ技术相结合，建立了测定血清中ＰＳＡ含量的ＡＢＣ－ＥＬＩＳＡ竞争法。此法较常规的ＥＬＩＳＡ敏感度高，较放免法安全、经济。本文对其方法的灵敏度、重复性、可靠性进行了探讨。测得正常男性血清ＰＳＡ范围是０～３．３ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝８６），女性血清ＰＳＡ未测出（ｎ＝１５）。     

PBAD表达系统对抗-HBs Fab抗体表达的影响

目的研究PBADP替换Plac的原核表达系统对重组抗-HBs Fabs的表达效率、产量及其抗体活性的影响。方法通过Western blot、抗体不同稀释度的Dot blot和抗原特异性结合实验，对两种表达系统进行比较。结果在PBAD控制下表达的抗．HBs Fabs与Plac控制下的相比，Western blot显示两种表达系统都能完整表达抗-HBs Fab抗体，Mr为50000。PBAD表达系统表达的抗-HBs Fabs多以可溶形式存在于周质腔中，而Plac表达系统表达的抗-HBs Fabs更多的释放入培养上清液。抗体不同稀释度的Dot blot结果显示pBAD-抗HBs Fab表达系统表达的抗体效价较pComb3-抗HBs Fad高，乙型肝炎表面抗原特异性结合实验证实两种表达系统表达的抗体的抗原结合活性无明显差别。结论PBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量并保持了原抗体活性。     

FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响

目的：观察FasL基因转染对大鼠肥大细胞凋亡的影响。方法：RT-PCR法扩增大鼠FasL穿膜区和胞外区cDNA，成功构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3，RT-PCR、免疫印迹法鉴定FasL在RBL-2H3上的表达，Annexinv流式细胞检测pcDNA3．1／FasL转染RBL-2H3后细胞的凋亡情况。结果：获得FasL穿膜区和胞外区eDNA，构建pcDNA3．1／FasL真核表达质粒，瞬时转染RBL-2H3后在细胞膜和上清均有FasL的存在，瞬时转染RBL-2H3后48小时，细胞发生凋亡。结论：吧大细胞可以通过Fas-FasL途径凋亡，为FasL基因应用于过敏性疾病的治疗提供依据。     

非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞的数量变化分析

检测不同分期非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞(PBDC)的数量差异及术后PBDC的数量变化,并探讨其临床意义。用流式细胞仪检测10名健康人、44例非小细胞肺癌患者PBDC亚群DC1和DC2。与正常健康人群相比,非小细胞肺癌患者外周血DC1/DC2的数量明显减少,并且分期越晚PBDC的数量越少;与术前基线相比,术后1个月时PBDC的数量均出现了一定程度的恢复,进一步检测发现Ia期患者在术后6月时PBDC数量接近正常水平。因此可以认为非小细胞肺癌细胞可导致PBDC数量减少,DC治疗前对肿瘤患者适当地减轻肿瘤负荷有可能提高抗肿瘤疗效。     

大鼠肥大细胞Fas的表达与功能研究

目的 研究大鼠肥大细胞表面Fas的表达情况及其功能。方法 应用RT-PCR和免疫印迹法检测Fas的转录和表达,并用免疫细胞化学法定位;应用annexinV流式细胞仪检测经抗大鼠Fas多克隆抗体诱导的RBL-2H3细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR扩增出Fas细胞外区474bp片段,免疫印迹证实肥大细胞有蛋白表达,免疫细胞化学证实肥大细胞膜表面有Fas表达,annexinV流式细胞仪检测发现在抗大鼠Fas多克隆抗体的诱导下RBL-2H3出现凋亡。结论 大鼠肥大细胞表面表达Fas,通过激活Fas途径可诱导肥大细胞凋亡。