用APP中的肽段免疫糖尿病小鼠减轻脑内Aβ表达的初步研究

１９９９年Ｓｃｈｅｎ氏等报道用Ａβ（β淀粉样肽）ｌ～４２多次免疫转基因小鼠，可获得高滴度的抗Ａβｌ～４２抗体，减少老年斑和相关神经病理改变［１，２］。我们以往的研究表明链脲佐菌素（ＳＴＺ）造模的糖尿病小鼠存在学习、记忆功能障碍，Ａβ类蛋白质表达增加［３，４］。但未知免疫抗体对糖尿病小鼠脑内Ａβ类蛋白质表达的影响。本研究用β淀粉样肽前体蛋白（ＡＰＰ）中的肽段免疫小鼠，待小鼠产生抗体后诱发糖尿病模型，观察小鼠脑内Ａβ及其前体蛋白的表达。 一、材料与方法 １．材料：ＡＰＰ１７肽、Ａβｌ～２８由我室合成纯…     

救脑益智胶囊对D-半乳糖老化小鼠海马神经元Aβ及其相关蛋白表达的影响

目的　观察中药救脑益智胶囊对 D-半乳糖老化小鼠 (DGAM)海马神经元β-淀粉样肽 (β-amyloid,Aβ)及其相关蛋白表达的影响。方法　采用免疫组织化学染色和免疫印记方法 ,检测 DGAM模型海马神经元 Aβ、β-分泌酶、内质网 Aβ结合蛋白和早老蛋白 -1的表达水平 ,并观察中药救脑益智胶囊对 DGAM的保护作用。结果　对照组小鼠海马 CA1区神经元有少量 Aβ及其相关蛋白表达 ,而 DGAM海马 CA1区神经元 Aβ及其相关蛋白表达水平明显增加 ,与对照组相比差异有显著性 (P <0 .0 1 ) ,中药组上述各种蛋白的表达与对照组相比差异无显著性。结论　 DGAM海马神经元存在 Aβ及其相关蛋白表达的上调 ,中药救脑益智胶囊可明显改善模型动物中上述蛋白的异常表达 ,对神经元具有一定的营养和保护作用。     

电镜观察糖尿病模型大鼠神经网膜的超微结构

为观察糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞的损害是否早于视网膜微循环改变 ,用链脲佐菌素 (STZ ,6 0mg/kg)建立糖尿病动物模型 ,分别于模型建立后 1周、2周、1月处死大鼠 ,电镜观察大鼠视网膜及其微血管的变化。结果 :与正常对照组比较 ,糖尿病大鼠于模型建立后 1周、2周 ,其神经网膜神经细胞和视网膜微血管无明显改变 ;模型建立后 1月 ,其视网膜色素上皮层、神经网膜微血管基底膜和周细胞无明显改变 ,但其神经网膜从外丛状层至神经纤维层有明显变化 ,表现为线粒体数目减少 ,线粒体肿胀 ,嵴变短、消失和髓样变性。神经纤维层和内、外网状层细胞突起水肿 ,在神经纤维层尤其明显 ,在神经节细胞层可见暗细胞形成。由于神经纤维层细胞突起水肿明显 ,压迫其周围微血管 ,导致微血管管腔狭窄 ,甚至闭锁 ,但微血管内皮细胞及基底膜未见异常。结果提示 :糖尿病早期大鼠在视网膜神经细胞损害已发生时 ,视网膜微血管内皮细胞和基底膜超微结构未见异常 ,神经网膜神经细胞的损害可能是糖尿病视网膜病变 (DR)的早期表现。     

老年痴呆发病机制的研究：APP17肽对β-淀粉样肽导致神经元毒性作用的影响

背景：老年斑是老年性痴呆(Alzheimer’s Disease，AD)的主要病理特征之一，以β-淀粉样肽(β-Amyloid，Aβ)沉积为核心，Aβ的神经元毒性定位于Aβ25-35。Aβ前体蛋白(β-amvloid proteln precursor，APP)中319-335肽段即APP17肽(APP17-mer peptide)，具有神经营养和神经保护作用。目的：通过观察APP17肽对AB引起神经毒性作用的影响，进一步证实此肽的神经营养作用，并为阐明AD的发病机制和临床治疗提供理论依据。设计：标准对照实验研究。地点和材料：本研究的地点为首都医科大学宣武医院神经生化研究室。SY5Y细胞株由瑞典卡罗琳斯卡研究所赠送，APP17肽和Aβ25-35由本室用固相法合成，高效液相纯化。方法：固相法合成APP17肽、Aβ25-35，高效液相纯化，以人神经母细胞瘤株SY5Y为细胞模型，分为正常对照组、Aβ25-35 10μmol／L损伤组和Aβ25-35 10μmol／L加APP17肽10μmol／L保护组。以细胞计数、噻唑蓝代谢率、乳酸脱氢酶漏出率、细胞轴突长度、胞体面积和细胞内游离钙离子(Ca^2+)浓度为观察指标。结果：与正常对照组相比，Aβ25-35损伤组轴突长度(35．74&;#177;16．25)和胞体面积(495．92&;#177;87．68)均缩小，细胞计数接种后第6天[(8．39&;#177;1．31)&;#215;10^7L^-1]减少，噻唑蓝代谢率降低，乳酸脱氢酶漏出率升高，细胞内游离钙离子浓度升高，而加入APP17肽保护后，可使上述指标恢复或接近正常。结论：APP17肽具有神经营养和神经保护作用，可减轻Aβ引起的神经元损伤。     

PI3K特异性抑制剂Wortmannin和APP17肽对SY5Y细胞胰岛素信号转导通路的作用

目的利用PI3K的特异性抑制剂Wortmannin阻断体外培养的人神经母细胞瘤株SY5Y细胞的存活信号转导通路，观察β淀粉样肽前体蛋白（APP）17肽对SY5Y细胞生长的影响及其作用机制。方法体外培养SY5Y细胞，分为对照组、Wortmannin组、APP17肽组、APP17肽＋Wortmannin组、葡萄糖组、葡萄糖＋APP17肽组、葡萄糖＋Wortmannin＋APP17肽组，观察各组细胞的噻唑蓝（MTT）代谢率、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、细胞轴突长度、胞体面积。结果（1）APP17肽可促进SY5Y细胞MTT代谢率升高、LDH漏出率降低、细胞轴突长度和胞体面积增加，但经Wortmannin作用后，其作用减弱。（2）APP17肽对高糖环境下的SY5Y细胞也有上述作用，且经Wortmannin作用后其作用减弱。结论APP17肽能通过激活胰岛素的PI3K信号转导通路发挥其神经保护作用。     

β淀粉样肽前体蛋白N端328-332(APP5肽)类似物神经营养作用的体外实验研究

目的研究卢淀粉样肽前体蛋白N端328—332（APP5肽）及其类似物对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，在体外寻找具有神经营养作用又能抵抗胃蛋白酶消化能力的5肽类似物。方法合成多个5肽类似物，以MTT代谢率进行筛选，选出最佳的5肽类似物，以人神经母细胞瘤株SY5Y作为体外实验模型，以MTT代谢率、细胞计数，LDH漏出率，Western blotting检测作为观察指标，进一步证实5肽类似物的神经营养作用。应用胃蛋白酶对APP5肽和类似物165进行消化实验，观察两者的酶解率。结果（1）APP5肽及由此基础上改造的多种类似物均可使SY5Y细胞MTT代谢率增高，而类似物165的效果最好，40μmol／L为最佳有效浓度。（2）APP5肽及类似物165可使SY5Y细胞MTT代谢率增高，LDH漏出率减少，细胞数量增加，SY5Y细胞P-CREB、Bcl-2蛋白表达增加。（3）胃蛋白酶消化实验显示，胃蛋白酶浓度为40g／L时，APP5肽和类似物165的酶解率分别为96．4％和16．9％；胃蛋白酶量为100g／L时，APP5肽和类似物165的酶解率为99．1％和58．6％，两者差异非常显著。5肽类似物165的抗酶解能力明显大于APP5肽。结论APP5肽及类似物165对SY5Y细胞具有神经营养作用，而APP5肽类似物165具有更强的抗胃蛋白酶消化能力。     

APP17肽对糖尿病KK小鼠肾脏的保护作用

目的：观察App17肽对2型糖尿病小鼠尿白蛋白、总蛋白排泄量和肾脏超微结构的影响。方法：KKAy小鼠，根据血糖水平分为：血糖正常组（C组），糖尿病组（D组）和17肽治疗组（D＋17P组），17肽治疗组给予APP17肽皮下注射。12周后将3组小鼠处死。处死前1d，用代谢笼收集小鼠24h尿量，测总蛋白、白蛋白值；处死时心脏取血测血糖及血胰岛素水平；取肾皮质送电镜检查。结果：（1）D组小鼠肾小球基底膜明显增厚，近曲小管出现大量空泡和退变钙化的线粒体，而线和D＿17P组小鼠无此改变。（2）三组小鼠尿总蛋白和尿白蛋白排泄量由低到高依次为C≤D＋17P≤D（P＜0．05）。（3）D组和D＋17P组小鼠的血糖、糖化血红蛋白、胰岛素水平比C组明显升高（P＜0．05），D组和D＋17P组之间差异无显著性（P＞0．05）。结论：App17肽对KKAy糖尿病小鼠肾脏病变具有保护作用，但不是通过影响血胰岛素和血糖水平实现的。     

APP17肽对DM大鼠海马神经元胰岛素和凋亡信号传导通路相关蛋白的影响

目的 观察糖尿病大鼠海马脑区胰岛素和凋亡信号传导通路中某些相关蛋白的表达及APP17肽对其表达的影响。方法 链脲佐菌素诱发大鼠糖尿病模型，并用APP17肽治疗。用免疫沉淀和Western-blot法分析海马中信号传导及部分凋亡相关蛋白；电镜观察大鼠脑组织超微结构。结果 DM大鼠IGF－IRα、Akt/PKB、CREB表明明显降低，APP17肽治疗后明显上调（P＜0．05），GSK－3β、PP－1及凋亡相关蛋白Bax、AIF表达增加，治疗后则明显降低（P＜0．05）；超微结构表明APP17肽治疗后兴奋性突触小泡明显减少。结论 糖尿病大鼠海马脑区胰岛素和凋亡信号传导通路中某些重要蛋白表达异常，APP17肽部分纠正这些蛋白的异常表达，这可能是其保护DM大鼠海马神经元的机制。     

APP17肽对糖尿病脑病小鼠海马IRS—1、IGF—1R表达的影响

目的 通过对胰岛素受体底物－1（IRS－1）、胰岛素样生长因子－1受体（IGF－1R）在海马表达的观察，研究APP17肽对糖尿病脑病小鼠海马神经元IRS－1、IGF－1R的影响。方法 用链脲佐菌素（STZ）诱发小鼠糖尿病模型，并皮下注射APP17肽对糖尿病小鼠进行治疗，4周后取脑组织做IRS－1、IGF－1R免疫组织化学染色。结果 糖尿病小鼠海马内IRS－1、IGF－1R阳性反应神经元胞浆与突起深染，而正常小鼠及APP17肽保护的糖尿病小鼠海马阳性细胞数目小，染色淡。结论 糖尿病小鼠海马IRS－1、IGF－1R广泛表达；APP17肽能影响糖尿病脑病小鼠脑内IRS－1，IGF－1R的表达，使之接近正常。     

Kh DIC小鼠海马神经细胞线粒体自由基水平的变化及APP17肽的影响

目的 观察Kh DIC（KM hn／IDL JIMP CAMS）小鼠海马神经细胞线粒体自由基水平的变化及APP17肽（β-amyloid precursor protein，APP，319-335肽段）的影响。方法 2．5月龄的Kh DIC小鼠随机分为模型组和APP17肽治疗组，正常对照组采用月龄和性别相匹配的正常昆明（KM）小鼠。APP17肽治疗组给予皮下注射APP17肽，每只每次0．34g-g，每周3次；模型组和正常对照给予等量的生理盐水；25W后成模。应用水迷宫试验观察小鼠学习、记忆功能的变化，应用羟胺法和硫代巴比妥酸（TBA）比色法分别检测了海马神经细胞线粒体抗氧化酶活性及自由基水平。结果 ①水迷宫结果显示，模型组小鼠存在明显的学习和记忆功能障碍，其游完全程的时间和错误反应次数均较正常对照组增多（P〈0．05）；APP17肽治疗组小鼠的行为学障碍明显轻于模型组，其上述的水迷宫检测结果与正常对照组比较无显著性差异。②与正常对照组比较，模型组小鼠海马神经细胞线粒体超氧化物歧化酶（SOD）活性明显降低（P〈0．01），丙二醛（MDA）含量显著升高（P〈0．01）；APP17肽治疗组检测结果与正常对照组接近，SOD活性高于模型组（P〈0．01），而MDA含量低于模型组（P〈0．01）。结论 ①Kh DIC小鼠存在学习和记忆功能障碍；而且其海马神经细胞线粒体氧化应激反应明显加剧。②APP17肽具有清除自由摹和抑制氧化应激反应的作用，从而提高脑组织的抗氧化能力，保护学习、记忆功能。