管花肉苁蓉花中二氢黄酮醇4-还原酶的克隆、表达分析和酶活性鉴定

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)是花色素苷生物合成途径的关键酶,在植物花色调控中发挥重要作用。本研究通过管花肉苁蓉花转录组数据分析,利用RT-PCR技术克隆出一条DFR基因并命名为CtDFR,其开放阅读框(ORF)长1 263 bp,编码420个氨基酸,蛋白分子质量为47.5 kDa。序列分析表明CtDFR具有NADPH结合域和底物特异性结合域。实时荧光定量PCR表明CtDFR在管花肉苁蓉的红、紫色花中高表达,相对表达量分别是白色花的4.04、19.37倍。构建原核表达载体pET-28a-CtDFR,转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中,成功表达CtDFR蛋白,纯化得到可溶性重组蛋白。体外酶活性分析表明,重组蛋白CtDFR能催化二氢山柰酚、二氢槲皮素、二氢杨梅素生成无色天竺葵素、无色矢车菊素、无色飞燕草素。亚细胞定位实验结果表明CtDFR主要定位于细胞质中。本研究结果表明CtDFR在管花肉苁蓉花色调控中起到重要作用,为进一步探讨管花肉苁蓉花色形成及调控机制研究奠定了基础。     

开心散抗抑郁作用的靶点群发现及分子机制研究

基于靶点“钩钓”策略鉴定开心散在脑组织中的抗抑郁靶点群，探索靶点群相关药理学信号通路，诠释开心散抗抑郁的分子机制。通过慢性不可预见性温和应激(CUMS)方式建立Balb/c小鼠抑郁模型，以糖水偏好及强迫游泳行为学实验评价开心散抗抑郁作用；进而利用光交联反应将开心散药效组分键合到磁性微球表面，形成开心散成分芯片，从抑郁小鼠脑皮层、丘脑、海马组织中捕获直接作用靶点蛋白，并通过液相色谱高分辨质谱联用(LC-MS/MS)进行鉴定；利用Cytoscape软件进行靶点蛋白通路富集分析，同时通过免疫组化和蛋白免疫印记等方法对可能的靶点生物学功能进行验证。研究发现，开心散对抑郁小鼠的行为学指标有明显改善作用；靶点鉴定实验发现开心散药效组分在皮层、丘脑和海马组织中的潜在作用靶点分别有64、91和44个，靶点功能主要与加压素调控的水重吸收、沙门菌感染、甲状腺激素合成等信号通路相关。免疫组化和免疫印记等分析表明，开心散上调了抑郁小鼠脑皮层中加压素(AVP)的表达，上调了小鼠丘脑中热休克蛋白60(HSP60)、细胞色素C氧化酶4(COX4)、促甲状腺激素释放激素(TRH)的表达，并下调了丘脑中的肿瘤坏死因子α...     

UPLC同时测定不同产地白术中3种白术内酯成分的含量

目的:建立UPLC同时测定白术中3种白术内酯成分含量分析方法。方法:样品以甲醇超声提取30 min进行处理。采用超高效液相色谱，以Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈(3.0 mm×150 mm, 2.7μm)为色谱柱，流动相水(A)-甲醇(B)梯度洗脱，流速0.5 mL·min^-1,柱温30℃,检测波长分别为220和276 nm,进样量3μL。采用IBM SPSS 27.0软件对24批白术进行聚类分析和主成分分析。结果:3个成分在考察的浓度范围内，浓度与峰面积之间呈良好的线性关系(r>0.999),回收率均在103.05%～106.35%,RSD 2.0%～3.3%。经聚类分析发现，24批白术药材可聚为四大类；经主成分分析发现，2个主成分因子的累计方差贡献率为98.975%(第一主成分、第二主成分的贡献率分别为92.124%、6.601%)。结论:该方法简便、快捷、准确且灵敏度高，对评控白术药材的质量提供参考。     

多酶催化级联反应在天然产物酶法合成中的应用研究进展

酶作为一种生物催化剂，具有催化效率高、反应选择性强、目标产物专一、反应条件温和、环境友好等优点，是合成复杂有机分子的重要工具。且随着基因测序技术、分子生物学、遗传操作等技术的不断发展，酶的多样性稳步增加，可催化的反应类型也逐步多元化。在酶催化合成过程中，大多数简单反应通过单酶催化即可完成，而很多复杂反应的发生往往需要2个或以上的酶参与催化。因此，将多个酶组合到一起，构建多酶催化级联反应已逐渐成为生物化学领域的一个研究热点。如今，越来越多结构复杂的天然产物的生物合成途径得到解析，具有新颖催化活性的次级代谢酶不断被鉴定、发现并组合应用于结构多样性天然/非天然小分子的酶法合成中。该文总结了一系列多酶催化级联反应的例子，着重介绍了级联催化方法在糖类、核苷类、黄酮类、萜类、生物碱类以及手性分子等化合物合成中的应用，并对多酶催化级联方法目前存在的问题、解决对策及未来发展方向进行了讨论与展望。     

管花肉苁蓉花中查耳酮合酶的基因克隆、功能鉴定与表达分析

目的 研究管花肉苁蓉Cistanche tubulosa花中查耳酮合酶（chalcone synthase）Ct CHS蛋白的功能和Ct CHS基因在白、红、紫3种颜色花中的表达模式。方法 利用RT-PCR克隆Ct CHS基因并进行生物信息学分析。将p ET-28a-CtCHS质粒转入大肠杆菌通过IPTG诱导蛋白表达。将Ct CHS重组蛋白与底物4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A孵育并利用HPLC和MS检测产物。将p CAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS质粒转入拟南芥原生质体观察CtCHS蛋白亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Ct CHS基因在3种颜色管花肉苁蓉花中的表达模式。结果 克隆出1条Ct CHS基因，开放阅读框（open reading frame,ORF）长度为1173 bp，编码390个氨基酸，蛋白相对分子质量为42 800，具有查耳酮合酶保守的催化残基Cys164、His303、Asn336。利用大肠杆菌外源表达Ct CHS蛋白并纯化获得重组蛋白。Ct CHS蛋白能够催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成柚皮素查耳酮。Ct CHS蛋白主要定位于细胞质。Ct C...